[发明专利]改进了对革兰氏阴性细菌的结晶紫-碘复合物的脱色的革兰氏染色方法

说明书

本申请涉及改进了对革兰氏阴性细菌的结晶紫‑碘复合物的脱色的革兰氏染色方法。本文中提供将生物材料染色以用于检测，且在一些例子中还鉴定微生物的目的的方法。使用慢作用脱色制剂，如一种包含1,2‑丙二醇或乙二醇的脱色制剂来对细菌革兰氏染色的方法可用于延长脱色步骤的时间，如此允许革兰氏染色方法的自动化。还提供用于在显微镜载玻片上实施自动化革兰氏染色的组合物和试剂盒。

本申请是申请日为2013年2月22日、中国申请号为201380020183.7、发明名称为“改进了对革兰氏阴性细菌的结晶紫-碘复合物的脱色的革兰氏染色方法”的发明申请的分案申请。

技术领域

本公开涉及，为了检测微生物以及在一些例子中鉴定微生物的目的，而对生物材料进行染色的方法。更具体地，本公开涉及用于在显微镜载玻片上实施自动化革兰氏染色的方法、组合物和试剂盒。

背景

革兰氏染色是一种公知的、普遍使用的微生物学技术，其用于微生物尤其是细菌的检测、分类和鉴定。革兰氏染色的最常见方法涉及四个步骤：染色、捕获、脱色和复染色。组织学实验室中常用的革兰氏染色已知是不稳定的，特别是由于脱色步骤中的波动所致。影响脱色步骤的变量包括溶剂强度、浓度、体积和暴露持续时间。在手动革兰氏染色过程中，脱色步骤常规使用醇或丙酮，且该步骤仅需数秒。然而，对于自动化染色过程，该脱色过程发生得太快。本公开针对在自动化染色平台上的革兰氏染剂脱色的问题。

概述

本文中提供了能自动进行革兰氏染色的方法、组合物和试剂盒。发明人已鉴定出延长革兰氏染色脱色步骤的组合物，其允许革兰氏染色的自动化，例如，使用自动化的和/或计算机执行的染色装备来实现自动化。

本文中提供了对样品(如在显微镜载玻片上的样品)进行革兰氏染色的方法。所述方法可用于检测和区分革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌。在一些例子中，所公开的革兰氏染色方法被用于检测并非细菌的微生物，如酵母(例如假丝酵母(Candida)和隐球酵母(Cryptococcus))。

在具体的例子中，所述方法包括使样品与慢作用脱色制剂(如一种包含1,2-丙二醇或乙二醇的制剂)在足以从革兰氏阴性细菌而非革兰氏阳性细菌显著除去初级染剂-捕获剂复合物的条件下接触。所述样品是先前与初级染剂(如结晶紫)和捕获剂(如碘)接触过的样品。在具体的例子中，所述方法包括革兰氏染色过程的一个或多个另外的步骤，如使所述样品与初级染剂在足以将革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的细胞壁和细胞膜染色的条件下接触；使所述样品与捕获剂在足以形成初级染剂-捕获剂复合物的条件下接触；使所述样品与复染剂在足以对已脱色的革兰氏阴性细菌进行染色的条件下接触，或其组合。

本文还提供能充当慢作用脱色制剂的组合物。在一个例子中，所述组合物包含至少80％的慢作用脱色剂(如1,2-丙二醇或乙二醇)和不超过20％的快作用脱色剂(如0.1-20％的快速作用脱色剂，例如乙醇或丙酮)。这类组合物可用作自动化革兰氏染色中的慢作用脱色制剂。

本文还提供用于自动化革兰氏染色的试剂盒。在一个例子中，所述试剂盒在容器中包含慢作用脱色制剂，如包含至少80％或至少90％的慢作用脱色剂(如1,2-丙二醇或乙二醇)和不超过20％的快作用脱色剂(如0.1-20％或1-10％的快速作用脱色剂，例如乙醇或丙酮)的制剂。在一些例子中，试剂盒可另外包含其他组分，如在容器中的一种或多种初级染剂；在容器中的捕获剂；在容器中的复染剂，显微镜载玻片，盖玻片，其他染剂，和对照载玻片。在具体的例子中，所述容器配置为与自动化革兰氏染色平台一起使用。

本发明涉及下述技术方案。

1.一种对样品进行革兰氏染色的方法，包括：

使所述样品与慢作用脱色制剂在足以从革兰氏阴性细菌而非革兰氏阳性细菌除去初级染剂-捕获剂复合物的条件下接触，其中所述样品事先已与初级染剂和捕获剂接触过。