[发明专利]丝素水凝胶包裹的过表达ncRNA的MSC外泌体制备方法与在抗后肢衰老中的应用

说明书

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及丝素水凝胶包裹的过表达ncRNA的MSC外泌体制备方法与在抗后肢衰老中的应用。本发明选用外泌体来传递ncRNA，进一步采用丝素蛋白水凝胶来包裹外泌体。实验表明，经包裹的外泌体能够缓慢和稳定的释放到细胞外基质中，提高了外泌体的滞留时间，并能够将过表达的ncRNA转运到细胞内。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及丝素水凝胶包裹的过表达ncRNA的MSC外泌体制备方法与在抗后肢衰老中的应用。

背景技术

衰老和很多人类疾病相关，如心血管疾病，神经退行性疾病，癌症和代谢功能障碍等疾病。由于全世界有大量人口经受着这些疾病，同时衰老相关表型造成老年人异常虚弱，因此很多人对了解衰老的原因以及如何预防衰老过程有着浓厚的兴趣。比如在心脏衰老的过程中，活性氧和TGF-β信号途径增加，基质金属蛋白酶和基质金属蛋白酶组织抑制剂之间的失衡以及线粒体中积累的DNA突变，这将会导致心血管平衡发生变化，随后增加心肌细胞体积，降低心肌细胞数量，增加心肌胞外基质沉积特别是胶原蛋白，最后导致左心室肥厚，纤维化和心脏舒张功能障碍。因此如何延缓个体器官衰老成为全人类迫在眉睫的任务。

目前涉及延缓衰老的相关治疗方法，例如，中药，运动和热量限制均通过减少产生有害的代谢副产物和激活“长寿途径”从而延长寿命。研究还发现，心脏祖细胞、心脏干细胞、胚胎干细胞和骨髓间充质干细胞来源的外泌体对心肌梗死后心脏发挥有益作用。此外非编码RNA(ncRNA)在心肌梗死和心脏衰老中发挥转录翻译后调控作用，特别是长度约22个核苷酸的微小RNA(miRNA)。一些异常表达的miRNA在心脏生理和衰老中发挥作用。例如，miR-34a在衰老的小鼠心脏和人类心脏中表达上调，沉默miR-34a会减少心肌细胞的凋亡，其机制是miR-34a通过靶定PNUTS影响DNA损伤反应途径从而减少端粒缩短和DNA损伤,下调miR-34a能明显延缓小鼠衰老状况。总之，对miRNA的研究表明，miRNA具有作为诊断衰老的标记物或治疗靶点的潜力。而心脏和后肢衰老过程中miRNA如miRNA-675均下调，并通过预测和实验验证该miRNA参与抑制衰老相关的的下游靶基因和分子通路。因此我们提出使用该miRNA mimics进行预防和延缓衰老。

因为miRNA是短链核苷酸序列，因此通过miRNA对个体治疗无个体间差异，能避免外来分子造成的免疫原性。miRNA治疗是近年发展起来的一项新型临床前沿技术，其原理是通过将miRNA移植到接近衰老的组织或者缺血的后肢组织，从而下调衰老相关的蛋白，延缓后肢的衰老进程，进而促进血流恢复，后肢耐力等。

裸露的miRNA容易受到血液组织液或细胞外基质内RNase的降解，因此提高miRNA运输到靶细胞的效率能进一步miRNA的治疗效果。目前常用的方法是采用miRNA分子进行治疗需要将miRNA分子与细胞外基质的酶隔离开来，以保证miRNA能稳定的运输到靶细胞内。目前常用的方法是将miRNA分子进行修饰(如锁核苷酸修饰)以及使用慢病毒过表达载体，纳米物质或水凝胶过表达miRNA载体或成熟的miRNA将其运输到靶定组织中。尽管最新研究表明，miRNA的锁核苷酸修饰和慢病毒过表达载体在传递miRNA时效果良好，但是锁核苷酸修饰对分子效果和后续的降解的影响未可知，而尽管慢病毒是在HIV-1(人类免疫缺陷I型病毒)病毒基础上改造而成的自身失活性的病毒载体系统，但是在大众的认知里直接注射慢病毒载体相对难以接受。因此使用对心脏有益的外泌体来递送miRNA，一方面避免了其与细胞外环境接触，另一方面，外泌体能和细胞膜融合或者被细胞内吞从而直接将miRNA递送到细胞内。由于衰老是一个自然而缓慢的过程，而使用外泌体传递miRNA的半衰期较短，而如何提高外泌体在组织中的滞留时间仍是研究的难点。为了模拟个体衰老过程中发生的细胞凋亡，增殖降低，炎症增加，身体机能下降等，我们拟采用小鼠后肢急性缺血模型来部分模拟组织的自然衰老。

发明内容