[发明专利]抗埃博拉病毒VP40蛋白单克隆抗体A2G7及其应用

说明书

本发明公开了一种抗埃博拉病毒VP40蛋白单克隆抗体A2G7及其应用。该单克隆抗体亚型为IgG1、κ型，能与ZEBOV‑VP40蛋白N端抗原肽特异性结合，发挥抗病毒效应；产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞是由免疫的BALB/C小鼠脾淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0经融合、筛选、克隆和传代流程筛选后获得的杂交瘤细胞，能稳定分泌A2G7，抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID No.1，轻链氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。A2G7具备拮抗扎伊尔型埃博拉病毒样颗粒的抗病毒效应，可以其它单抗联合应用。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及抗扎伊尔型埃博拉病毒VP40蛋白单克隆抗体的制备及应用，是利用细胞工程、抗体工程技术，获得分泌抗VP40蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞系，通过同品系的小鼠诱导腹水，制备抗VP40蛋白的单克隆抗体A2G7，鉴定为IgG1、κ型，通过基因测序明确抗体的序列，再通过亲和纯化、电泳、免疫、基因工程等技术实现对该抗体的应用。

背景技术

埃博拉病毒病是由埃博拉病毒感染引起的致死性出血热。1976年，埃博拉病毒首次在苏丹南部和刚果（金）（旧称扎伊尔）发现，后陆续在中非地区小规模爆发，截止2013年，共造成2387人发病，死亡1310例，病死率54.9%。2014年埃博拉病毒再次爆发，以扎伊尔型埃博拉病毒为主要毒株，席卷西非，并跨越大洲，美国、英国、西班牙相继发生埃博拉病例。截止2016年12月31日，共报告28712例病例（含确诊及可疑病例），死亡11372例，死亡率39.6%。尽管自西非疫情以来，针对埃博拉病毒快速诊断、抗病毒药物、疫苗等研究等方面已经取得很大进展，但目前国际上仍没有特异的治疗手段和可供临床推广应用的疫苗。埃博拉病毒病已经成为国际性重大传染病，研究抗埃博拉病毒治疗对人类的安全至关重要。

研究表明，埃博拉病毒GP及VP40蛋白在埃博拉病毒病的致病机制中担任重要作用，GP蛋白与病毒入侵、胞膜融合密切相关，VP40蛋白在促进膜融合，维持病毒颗粒完整性,协助病毒出芽等方面发挥重要作用。因此，GP及VP40蛋白是研究药物、疫苗等的重要靶点。目前，有多种埃博拉病毒GP及VP40单克隆抗体得到鉴定，但多数用于快速诊断，仅有数个GP单克隆抗体在灵长类动物模型上验证了抗病毒效应，譬如，GP单克隆抗体mAb114; 2个GP单克隆抗体的联合抗体MIL77E；3个GP单克隆抗体的联合：MB-003, ZMab 和 ZMapp^TM。当前，仅ZMapp^TM 正在开展I/II期临床试验。但是具备抗埃博拉病毒效应的VP40单克隆抗体未见报道。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种抗埃博拉病毒VP40蛋白单克隆抗体A2G7及其应用。

一种抗埃博拉病毒VP40蛋白单克隆抗体A2G7，该单克隆抗体亚型为IgG1、κ型，能与ZEBOV-VP40蛋白N端抗原肽特异性结合，发挥抗病毒效应；

产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞是由免疫的BALB/C小鼠脾淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0经融合、筛选、克隆和传代流程筛选后获得的杂交瘤细胞，能稳定分泌A2G7，抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID No.1，轻链氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

一种所述的单克隆抗体A2G7的制备方法，通过以下步骤获得：

（1）小鼠免疫：选择6周龄的BALB/C雄性小鼠，以针对ZEBOV-VP40蛋白N端的特异的抗原肽15肽 ARSNSTIARGGNSNC ，SEQ ID No.3，对小鼠进行免疫，总共免疫3次，第1次免疫予100μg抗原肽加佐剂混匀后予小鼠大腿内侧肌肉注射免疫，第21天时，同等剂量抗原肽及佐剂混合物免疫第2次，第35天时，同等剂量抗原肽及佐剂混合物免疫第3次；第38天处理小鼠，用于融合实验；

（2）小鼠骨髓瘤细胞的培养：培养小鼠骨髓瘤细胞SP2/0并使其保持良好的生长状态用于杂交瘤细胞融合；