[发明专利]肝星状细胞分离纯化用的复合免疫磁珠及其制备方法

说明书

本发明涉及细胞分离纯化材料技术领域，尤其涉及肝星状细胞分离纯化用的复合免疫磁珠及其制备方法，所述复合免疫磁珠为粒径50～1500nm的磁珠颗粒上接枝抗体，所述抗体包括CD11b抗体和CD146抗体，所述磁珠颗粒的内核为Fe₃O₄微球，由内至外包括羧基化石墨烯层、改性壳聚糖层、海藻酸钠层。本发明通过在磁珠颗粒上接枝抗体，得到复合免疫磁珠，磁珠颗粒上含有较多的羧基官能团，在溶液中具有良好的分散性能，不容易发生团聚，且抗体在该磁珠颗粒上的接枝率较高，结合的稳性较强，可用于肝星状细胞的分离纯化，以便得到纯度较高、活性较强的肝星状细胞。

技术领域

本发明涉及细胞分离纯化材料技术领域，尤其涉及肝星状细胞分离纯化用的复合免疫磁珠及其制备方法。

背景技术

肝脏细胞分为肝实质细胞和非实质细胞，非实质细胞包括肝窦内皮细胞(LSECs)、Kupffer细胞(KCs)、肝星状细胞(HSCs)和隐窝细胞。肝星状细胞的形态不规则，胞体呈圆形或不规则形，常伸出数个星状胞突包绕着肝血窦。肝星状细胞质内有1～14个直径约1.0～2.0μm的脂滴，脂滴里面富含维生素A，在紫外线激发下能自发蓝绿色荧光。

自1953年Anderson创剪切法从肝脏分离肝细胞以来，各实验室对肝细胞的分离方法进行了不断改进，主要分为非灌流的方法和灌流的方法。非灌流的方法以其简单易行的特点得到了一定的应用，但由于存在消化不完全、分离得到的细胞中存在多细胞团块的问题，不能满足许多基础研究或临床应用的要求；灌流可以使消化液与肝组织更加充分地接触，提高了分离效率，以及所得肝细胞的活力和数量大大提高。目前，利用肝星状细胞在肝组织细胞中密度最低的原理，常采用两步灌流法结合密度液梯度离心法，分离出肝星状细胞。但是，肝星状细胞的平均密度为1.053g/ml，KCs细胞的平均密度为1.076g/ml，而LSECs细胞的密度范围为1.061～1.080g/ml，可见，肝星状细胞、KCs细胞和LSECs细胞的密度差别不是很大，利用两步灌流法和密度液梯度离心法很难分理出纯度较高的肝星状细胞，分离出的肝星状细胞中混杂有LSECs细胞、KCs细胞。

免疫磁珠法是20世纪80年代出现的技术方法。1983年Ugelstad提出将免疫磁珠用于细胞分选，1990年，Mihenyi建立了MACS。这一方法的核心是在磁珠表面包被具免疫反应性的抗体进行抗原抗体反应，在细胞表面形成玫瑰花结，这些结合了磁珠的细胞一旦置于强大的磁场下，就会与其他未被结合的细胞分群，具超强顺磁场的磁珠脱离磁场后立即消失磁性，这样就可以筛选或去除所标记的细胞，从而达到阳性或阴性选择细胞的目的。这一技术目前已经广泛运用于细胞及分子生物学，分离基因、靶细胞及造血干细胞等。其分离效果得到了免疫荧光、PCR、FISH及FACS等方法的确认。免疫磁珠可以有效地分选细胞，从而决定了这一方法在肝星状细胞分离纯化中应用的技术可行性。但是，目前的免疫磁珠存在分散性能较差，容易发生团聚，免疫磁珠上的抗体接枝率较低，且与抗体结合的稳定性较差。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是提供肝星状细胞分离纯化用的复合免疫磁珠及其制备方法，通过在磁珠颗粒上接枝抗体，得到复合免疫磁珠，磁珠颗粒上含有较多的羧基官能团，在溶液中具有良好的分散性能，不容易发生团聚，且抗体在该磁珠颗粒上的接枝率较高，结合的稳性较强，可用于肝星状细胞的分离纯化，以便得到纯度较高、活性较强的肝星状细胞。

本发明通过以下技术手段解决上述技术问题：

肝星状细胞分离纯化用的复合免疫磁珠，所述复合免疫磁珠为粒径50～1500nm的磁珠颗粒上接枝抗体，所述磁珠颗粒的内核为Fe₃O₄微球，由内至外包括羧基化石墨烯层、改性壳聚糖层、海藻酸钠层。