[发明专利]干细胞聚集体悬浮组合物及其分化方法

权利要求书

1.包含人胚胎干细胞衍生的细胞悬浮聚集体的生物反应器，其中所述人胚胎干细胞衍生的细胞悬浮聚集体通过包括以下的方法生成：

a.提供未分化的贴壁人胚胎干细胞培养物；

b.将步骤(a)的所述贴壁人胚胎干细胞培养物解离为人胚胎干细胞单细胞悬浮液；

c.将所述人胚胎干细胞单细胞悬浮液接种在支持所述人胚胎干细胞未分化生长的限定培养基中，由此形成人胚胎干细胞单细胞悬浮培养物；

d.以低剪切力搅动所述人胚胎干细胞单细胞悬浮培养物，其中所述悬浮液中的人胚胎干细胞单细胞形成基本上均一的人胚胎干细胞聚集体；以及

e.使所述人胚胎干细胞悬浮聚集体与分化培养条件接触，其中人胚胎干细胞悬浮聚集体形成人胚胎干细胞衍生的细胞悬浮聚集体，

由此生成人胚胎干细胞衍生的细胞悬浮聚集体。

2.如权利要求1所述的生物反应器，其中所述分化培养条件包含选自以下的成员的至少一种组分：成纤维细胞生长因子家族、表皮生长因子家族、角质细胞生长因子家族、生长和分化因子家族拮抗剂、视黄酸、凋亡抑制剂、TTNPB、Rho-激酶抑制剂、TGFβ超家族生长因子抑制剂、TGFβ超家族生长因子、WNT因子家族、hedgehog因子家族抑制剂、胰岛素样生长因子家族抑制剂和notch抑制剂。

3.如权利要求1所述的生物反应器，其中所述人胚胎干细胞聚集体在没有传代的情况下是分化的。

4.如权利要求1所述的生物反应器，其中所述人胚胎干细胞聚集体在无饲养层、无基质和无贴壁生长培养物的环境下是分化的。

5.如权利要求1所述的生物反应器，其中搅动所述人胚胎干细胞单细胞悬浮培养物通过旋转实施。

6.如权利要求5所述的生物反应器，其中在60rpm至160rpm下旋转所述人胚胎干细胞聚集体。

7.如权利要求1所述的生物反应器，其中所述贴壁人胚胎干细胞是人胚胎干细胞。

8.如权利要求1所述的生物反应器，其中所述生物反应器是大规模培养。

9.如权利要求1所述的生物反应器，其中所述生物反应器包含多个人胚胎干细胞衍生的细胞聚集体，所述细胞聚集体的大小、和/或形状实质上是均一的。

10.如权利要求1所述的生物反应器，其中所述人胚胎干细胞衍生的细胞聚集体悬浮在生理学上可接受的培养基中。

11.如权利要求10所述的生物反应器，其中所述培养基不含胰岛素、和/或IGF1。

12.如权利要求1所述的生物反应器，其中所述人胚胎干细胞衍生的细胞聚集体表达选自以下的至少一种标志物：brachyury,SOX17,FOXA2,HNF1β,PDX1,NKX6.1,NKX2.2,INS,GCG,SST,SOX7和PTF1A。

13.如权利要求1所述的生物反应器，其中所述人胚胎干细胞衍生的细胞聚集体是选自内胚层、外胚层和中胚层的细胞。

14.如权利要求1所述的生物反应器，其中所述人胚胎干细胞衍生的细胞聚集体是选自定形内胚层细胞聚集体、前肠内胚层细胞聚集体或者PDX1+内胚层细胞聚集体的细胞聚集体。

15.如权利要求1所述的生物反应器，其中所述生物反应器是搅拌罐生物反应器。

16.如权利要求1所述的生物反应器，其还包含用于控制包含pH、气体或温度的至少一种环境条件的装置。

17.如权利要求1所述的生物反应器，其中所述人胚胎干细胞衍生的细胞聚集体分批补料。

18.如权利要求1所述的生物反应器，其中所述生物反应器包括含有流体营养培养基的容器，所述人胚胎干细胞衍生的细胞聚集体悬浮在所述流体营养培养基中。