[发明专利]醇脱氢酶突变体及其在双芳基手性醇合成中的应用

权利要求书

1.一种醇脱氢酶的突变体，其特征在于，所述突变体是将氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示醇脱氢酶的一个或多个氨基酸位点进行突变。

2.根据权利要求1所述突变体，其特征在于，所述突变体是将氨基酸序列为SEQ IDNo.2醇脱氢酶的第214位谷氨酸、第237位丝氨酸中的一个或两个位点进行突变。

3.根据权利要求1或2所述突变体，其特征在于，所述突变体位以下M1～M16：

M1是将氨基酸序列如SEQ ID No.2所示醇脱氢酶的第214为谷氨酸替换为缬氨酸；

M2是将氨基酸序列如SEQ ID No.2所示醇脱氢酶的第214为谷氨酸替换为酪氨酸；

M3是将氨基酸序列如SEQ ID No.2所示醇脱氢酶的第214为谷氨酸替换为异亮氨酸；

M4是将氨基酸序列如SEQ ID No.2所示醇脱氢酶的第214为谷氨酸替换为甘氨酸；

M5是将氨基酸序列如SEQ ID No.2所示醇脱氢酶的第214为谷氨酸替换为谷氨酰胺；

M6是将氨基酸序列如SEQ ID No.2所示醇脱氢酶的第214为谷氨酸替换为丝氨酸；

M7是将氨基酸序列如SEQ ID No.2所示醇脱氢酶的第214为谷氨酸替换为天冬酰胺；

M8是将氨基酸序列如SEQ ID No.2所示醇脱氢酶的第214为谷氨酸替换为谷氨酰胺；

M9是将氨基酸序列如SEQ ID No.2所示醇脱氢酶的第214为谷氨酸替换为缬氨酸，同时将237位点的丝氨酸替换成丙氨酸；

M10是将氨基酸序列如SEQ ID No.2所示醇脱氢酶的第214为谷氨酸替换为酪氨酸，同时将237位点的丝氨酸替换成丙氨酸；

M11是将氨基酸序列如SEQ ID No.2所示醇脱氢酶的第214为谷氨酸替换为异亮氨酸，同时将第237位点的丝氨酸替换成丙氨酸；

M12是将氨基酸序列如SEQ ID No.2所示醇脱氢酶的第214为谷氨酸替换为甘氨酸，同时将第237位点的丝氨酸替换成半胱氨酸；

M13是将氨基酸序列如SEQ ID No.2所示醇脱氢酶的第214为谷氨酸替换为谷氨酰胺，同时将第237位点的丝氨酸替换成半胱氨酸；

M14是将氨基酸序列如SEQ ID No.2所示醇脱氢酶的第214为谷氨酸替换为丝氨酸，同时将第237位点的丝氨酸替换成半胱氨酸；

M15是将氨基酸序列如SEQ ID No.2所示醇脱氢酶的第214为谷氨酸替换为天冬酰胺，同时将第237位点的丝氨酸替换成半胱氨酸；

M16是将氨基酸序列如SEQ ID No.2所示醇脱氢酶的第214为谷氨酸替换为精氨酸，同时将第237位点的丝氨酸替换成半胱氨酸。

4.编码权利要求1-3任一所述突变体的核苷酸序列。

5.表达权利要求1-3任一所述突变体的重组菌。

6.构建权利要求5所述重组菌的方法，其特征在于，具体步骤如下：将编码所述突变体的核苷酸序列克隆到重组载体中，将所得重组载体转化到宿主中，得到重组转化体，通过培养所得重组表达转化体，即可分离纯化获得所述突变体。

7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述重组菌的宿主为大肠杆菌(Escherichiacoli)，所述质粒为pET28a(+)。

8.根据权利要求6或7所述方法，其特征在于，重组菌的宿主为E.coli BL21(DE3)。

9.应用权利要求5所述重组菌生产醇脱氢酶突变体的方法，其特征在于，所述方法为：将重组菌接种至含有40-60μg/mL硫酸卡那霉素的LB培养基中，30～40℃，100～200rpm摇床培养，培养液的吸光度OD₆₀₀达到0.5～1.0时，加入0.05～1.0mM的异丙基-β-D-六代呋喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导，诱导温度为16～30℃，诱导5～10h即可获得高效表达重组醇脱氢酶的突变体。

10.一种应用醇脱氢酶生产手性CPMA的方法，其特征在于，所述方法的具体步骤如下：构建反应体系，CPMK浓度为10-500mM，权利要求1-3任一所述脱氢酶突变体用量为1-10kU/L，NADP⁺用量为0.1～1.0mM，加入辅酶循环系统，辅酶循环系统中含有葡萄糖脱氢酶GDH和D-葡萄糖，其中葡萄糖脱氢酶GDH用量为1～10kU/L，D-葡萄糖用量为20～1000mM，磷酸盐缓冲液的浓度为0.1-0.2M；在30～35℃，pH 6～8的条件下反应1～24h，不对称还原反应结束后，可按照有机溶剂萃取方法从反应液中提取手性CPMA；所述辅酶循环系统还可以是亚磷酸盐/亚磷酸盐脱氢酶(FTDH)、甲酸/甲酸脱氢酶(FDH)、乳酸/乳酸脱氢酶(LDH)或甘油/甘油脱氢酶。