[发明专利]一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶生产菌株及其固定化方法

说明书

本发明公开了一种D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶生产菌株及其固定化方法，属于生物工程技术领域。本发明构建了产D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌pHY300PLK‑DPEase，以该重组菌作为生产菌株，固定化细胞后酶活回收率达64％，固定化细胞的最适温度较全细胞提高了5℃，最适pH无明显变化；以300g/L的果糖为底物连续转化7次，转化率仍可达28％，残留酶活还有81％。该固定化方法简单易行，固定化颗粒性能优异，具有很高的工业化应用价值。

技术领域

本发明涉及一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶生产菌株及其固定化方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

稀少糖是指一类在自然界中存在但含量极少的一类单糖及其衍生物，目前已发现的稀少糖种类有34种，这些稀少糖作为新型的功能型甜味剂，其已被广泛应用于膳食、医药和保健等领域。D-阿洛酮糖是D-果糖C3位上的同分异构体，属于稀少糖的一种。它的甜度是蔗糖的70％，但是能量值只有其0.3％，因此具有多种独特的生理学和营养学功能。

D-阿洛酮糖在自然界中存在极少，目前大多通过酶法催化生产D-阿洛酮糖，但是酶法催化也存在不足，例如重组酶稳定性差不足以满足工业化生产的需求，而且酶液无法重复利用成本较高。D-阿洛酮糖3-差向异构酶(DPEase)，可催化D-果糖C3位置差向异构化从而获得D-阿洛酮糖。近几年来，不同来源的微生物被逐渐发现并在宿主中进行克隆表达，但是D-阿洛酮糖作为一种食品添加剂，安全性问题显得尤为重要。

枯草芽孢杆菌作为一种食品安全菌，属于GRAS微生物，不存在内毒素等安全性问题，被广泛应用于各种工业酶制剂中。而且枯草芽孢杆菌作为表达系统具有高效的目的蛋白分泌能力和发酵条件简单等优点，非常适合作为DPEase的表达宿主。但是目前关于DPEase报道都集中在寻找不同来源的基因进行克隆表达，存在表达量低的问题。2016年来自天津工业微生物研究所的孙媛霞团队，通过筛选合适的启动子，最终在7.5-L发酵罐中重组枯草芽孢杆菌产DPEase酶活可达95U/mL，是目前报道的最高水平。较低的蛋白表达无法满足生产需要。因此选取一株高产DPEase酶蛋白的生产菌株显得尤为重要。

因为DPEase天然状态下是一种胞内酶，破壁得到工业化生产所需的大量酶液不仅耗时费力，而且成本高。在工业化生产D-阿洛酮糖的过程中，游离酶无法重复使用，同时游离酶一般热稳定性差，不适合工业化的连续生产。

发明内容

本发明第一个目的在于提供一种表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的重组菌，所述重组菌以枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis(CCTCC M2016536)为宿主，表达来源于解纤维梭菌的D-阿洛酮糖3-差向异构酶。

在本发明的一种实施方式，所述编码D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式，所述重组菌的构建方法为：将核苷酸序列为SEQ IDNO.1的D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因连接到表达载体pHY300PLK上，构建重组质粒pHY300PLK-DPEase，将重组质粒pHY300PLK-DPEase转入枯草芽孢杆菌后得到重组菌。

本发明第二个目的是提供一种利用所述的枯草芽孢杆菌生产D-阿洛酮糖3-差向异构酶的方法，所述方法具体步骤如下：将重组菌接种于LB液体培养基中，于35-38℃、150-250rpm培养8-10h，然后以3-6％的接种量接种至TB培养基中，于30-33℃、150-200rpm培养40-52h。将获得的发酵液稀释后，超声破壁离心后即获得破壁上清粗酶液。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵液稀释至OD₆₀₀为4-5。

本发明的第三个目的是提供一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶的固定化细胞方法，所述固定化细胞的方法步骤如下：