[发明专利]一种高产环糊精葡萄糖基转移酶的基因工程菌

说明书

本发明公开了一种高产环糊精葡萄糖基转移酶的基因工程菌，属于基因工程技术领域。本发明构建pHYα/βCGTd4、pHYα/βCGTd4‑sp1和pHYα/βCGTd4‑sp1‑βN三种Bacillus stearothermophilus来源的环糊精葡萄糖基转移酶表达质粒，并转化表达宿主枯草芽孢杆菌WSH13，得到三种表达环糊精葡萄糖基转移酶的重组工程菌B.subtilis WSH13(pHYα/βCGTd4)、B.subtilis WSH13(pHYα/βCGTd4‑sp1)、B.subtilis WSH13(pHYα/βCGTd4‑sp1‑βN)，摇瓶酶活分别为7.99U/mL、11.99U/mL和12.65U/mL，3L罐酶活分别为110.4U/mL、150.3U/mL和225.9U/mL。

技术领域

本发明涉及一种高产环糊精葡萄糖基转移酶的基因工程菌，属于基因工程领域。

背景技术

维生素C是一种水溶性维生素，参与人体多项生理活动，广泛应用于食品、医药、化妆品等领域。然而，由于自身不稳定，易被氧化降解的性质，严重影响应用。因此VC衍生物成为研究热点，其中2-O-α-D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸(AA-2G)，具有Vc正常生理功能、安全性高，并且在胞外稳定存在，成为很好的VC替代品。环糊精葡萄糖基转移酶(CyclodextrinGlycosyltransferase，简称CGTase，EC 2.4.1.19)具有环化、歧化和耦合三种转糖基反应和水解反应。CGTase利用偶联和歧化两种特异转糖基作用将淀粉、环糊精等葡萄糖基供体上的葡萄糖苷转移到Vc的C-2位上，得到产物AA-2G_n(n＝1，2，3，4，5，6，7)，再利用葡糖淀粉酶(glucoamylase)将AA-2G_n较长的糖链降解为成只连接一个葡萄糖基团的AA-2G。影响AA-2G转化效率的关键是糖基转移酶的选择，目前为止，有报道的用于AA-2G合成的糖基转移酶共有5种，分别为α-淀粉酶(α-amylase)、α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase)、蔗糖磷酸化酶(sucrose phosphatase)、α-异麦芽糖基葡糖基糖合成酶(α-isomaltosylglucosaccharide-forming enzyme)和环糊精葡萄糖基转移酶(cyclodextringlycosyltransferase)。其中尤以环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)的强产物特异性而使其成为目前AA-2G生物合成中使用最广泛的酶种。B.Stearothermophilis来源的α/β-环糊精葡萄糖基转移酶(α/β-CGTase)具有合成AA-2G的优良性能。本实验室已成功将α/β-CGTase在E.coli异源表达，但AA-2G作为食品、医药添加剂，需要以食品安全菌株作为宿主生产CGTase。

枯草芽孢杆菌B.subtilis是一类广泛分布革兰氏阳性杆状好养型细菌，具备无致病性，环境兼容性好、不易产生抗药性等优点，而且还具有良好的发酵基础，其培养简单快速，具有较强的分泌蛋白质的能力，目前广泛用于生产各种工业用酶。枯草芽孢杆菌遗传背景清晰，实验模式菌株B.subtilis 168已完成全基因组测序，并根据发酵工艺需求改造成多种突变体，例如工业上使用的菌株B.subtilis WB600和B.subtilis WB800。B.subtilisWSH13是本实验室以B.subtilisATCC 6051a为出发菌株经过定向基因组改造，实现高密度发酵的菌株，减少了发酵过程泡沫、芽孢、胞外淀粉酶和蛋白酶的产生。

为了提高CGTase在枯草枯草芽孢杆菌的异源表达，处理选择合适的表达载体和启动子外，筛选出匹配度高的信号肽也是提高表达量的有效手段。不同的信号肽对不同的异源蛋白表达量的影响不尽相同，毛婷等在枯草芽孢杆菌WB600表达系统筛选不同信号肽(est A、bpr、vpr、ync M、yvg O和ywb N)对CGTase表达量的影响，在相同的发酵条件下，estA信号肽介导的分泌效果最好。前人筛选信号肽所用的样本量较小，通过高通量平台从大样本中筛选出一个适合α/β-CGTase的信号肽就显得尤为重要。

发明内容