[发明专利]从微量样品中提取和消化蛋白质的方法、定量检测及应用

权利要求书

1.一种从微量样品中提取和消化蛋白质的方法，其特征在于，包括：

向样品中加入裂解液，进行裂解，所述裂解液包括蛋白变性剂和蛋白酶抑制剂，所述裂解液中含有可挥发的碱性试剂，所述蛋白变性剂为可适用于质谱上机鉴定的质谱兼容性变性剂；

将裂解后的组织样品进行超声处理；

向超声处理后的样品中加入还原剂进行温育，然后加入烷基化试剂进行烷基化处理；

向经过烷基化处理后的溶液中加入胰蛋白酶进行酶解；

向酶解后的样品中加入酸性试剂，然后离心取上清，得到肽段溶液。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述超声处理为接触式超声处理，优选为探针超声处理；

所述超声处理的时间为1～2分钟，功率为40～100W；

任选地，所述超声处理按照超声2～3秒，停止2～3秒重复。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述蛋白变性剂为RapiGest或脱氧胆酸钠；

任选地，所述RapiGest的质量浓度为1～5％，所述脱氧胆酸钠的质量浓度为1～5％，

所述蛋白酶抑制剂为苯甲基磺酰氟(PMSF)。

4.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，所述可挥发的碱性试剂为第一弱碱试剂，所述第一弱碱试剂包括选自碳酸氢铵、氨水、乙酸铵中的至少一种；

任选地，所述第一弱碱溶液为碳酸氢铵。

5.根据权利要求1～4任一项所述的方法，其特征在于，加入所述还原剂后在45～65℃条件下，温育30分钟～2小时；

任选地，所述还原剂为二硫苏糖醇或三(2-羧乙基)膦溶液；

任选地，所述二硫苏糖醇溶液的作用浓度为5mM～10mM，所述三(2-羧乙基)膦溶液的作用浓度为5mM～10mM。

6.根据权利要求1～5任一项所述的方法，其特征在于，加入烷基化试剂后在室温避光放置30分钟～45分钟；

任选地，所述烷基化试剂为碘乙酰胺或甲基甲硫甲基亚砜溶液；

任选地，所述碘乙酰胺溶液的作用浓度为20mM～40mM，所述甲基甲硫甲基亚砜溶液的作用浓度为20mM～40mM。

7.根据权利要求1～6任一项所述的方法，其特征在于，在加入胰蛋白酶酶解之前加入第二弱碱试剂，所述第二弱碱试剂包括选自碳酸氢铵、氨水、乙酸铵中的至少一种；

任选地，所述第二弱碱试剂为碳酸氢铵。

8.根据权利要求1～7任一项所述的方法，其特征在于，所述酶解的条件为37℃下水浴4～8小时；

任选地，所述胰蛋白酶的浓度为0.1μg/μL～0.3μg/μL；

任选地，所述胰蛋白酶为测序级的胰蛋白酶；

任选地，所述酸性试剂选自甲酸(FA)、三氟乙酸、乙酸、柠檬酸中的至少一种；

任选地，所述方法可适用于低至0.1μg蛋白样品的提取和消化；

任选地，所述微量样品为组织样品或者细胞样品，优选为切片组织样品或穿刺组织样品。

9.一种对微量样品中提取的肽段进行定量检测的方法，其特征在于，

将权利要求1～8任一项所述的肽段溶液利用液相色谱-质谱联用进行非依赖性数据(DIA)检测。

10.一种用于从微量组织中提取和消化蛋白质的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括试剂套装，所述试剂套装包括：

试剂A，所述试剂A为裂解液，所述裂解液包括蛋白变性剂和蛋白酶抑制剂，所述蛋白变性剂为RapiGest或脱氧胆酸钠，所述蛋白酶抑制剂为苯甲基磺酰氟(PMSF)，所述裂解液中含有可挥发的碱性试剂，所述可挥发的碱性试剂选自碳酸氢铵、氨水、乙酸铵中的至少一种，

试剂B，所述试剂B为二硫苏糖醇或三(2-羧乙基)膦溶液，

试剂C，所述试剂C为碘乙酰胺或甲基甲硫甲基亚砜MMTS溶液，

试剂D，所述试剂D为胰蛋白酶溶液，

当试剂B为二硫苏糖醇溶液时，试剂C为碘乙酰胺溶液，当试剂B为三(2-羧乙基)膦溶液时，试剂C为甲基甲硫甲基亚砜溶液；

任选地，所述试剂套装进一步包括试剂E，所述试剂E为酸性试剂，所述酸性试剂选自甲酸(FA)、三氟乙酸、乙酸、柠檬酸中的至少一种；

任选地，所述试剂套装进一步包括试剂F，所述试剂F选自碳酸氢铵、氨水、乙酸铵中的至少一种；

任选地，所述RapiGest的质量浓度为1～5％，所述脱氧胆酸钠的质量浓度为1～5％；

任选地，所述二硫苏糖醇溶液的浓度为5mM～10mM，所述三(2-羧乙基)膦溶液的作用浓度为5mM～10mM；

任选地，所述碘乙酰胺溶液的作用浓度为20mM～40mM，所述甲基甲硫甲基亚砜溶液的作用浓度为20mM～40mM；

任选地，所述胰蛋白酶溶液的作用浓度为0.1μg/μL～0.3μg/μL。