[发明专利]一种诱导骨髓基质干细胞向神经细胞分化的方法

说明书

本发明涉及一种诱导骨髓干细胞向神经细胞分化的方法。属骨髓干细胞分化为神经干细胞的方法。本发明在实施过程中取自体的骨髓干细胞和嗅鞘细胞，可排除异性蛋白排斥反应，避免道德和伦理压力，减轻病人经济负担；培养过程中采取分阶段诱导骨髓干细胞分化，诱导神经细胞前体进一步分化为成熟细胞，从而获得生物性状稳定，体外存活时间长，分化成熟的神经细胞。在培养过程向培养基中加入一定量的海藻糖和蔗糖，意外的发现海藻糖和蔗糖的加入使细胞分化为神经前体细胞的比例增加，分化周期缩短，从而可以短时间内得到大批量的成熟神经细胞。

技术领域

本发明涉及诱导干细胞治疗的技术领域，具体是一种诱导骨髓基质干细胞向神经细胞分化的方法。

背景技术

脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)常导致患者肢体瘫痪、大小便失禁及性功能障碍，是一种严重影响患者身心健康的常见病、多发病。随着现代化交通和工业的快速发展，脊髓损伤的发病率正在逐年增加，美国年发病率为20-40人/百万人口，我国脊髓损伤的年发病率约为15-20人/百万，而最新数据显示北京地区年发病率已达到惊人的60人/百万。脊髓损伤的修复是长期困扰医学界的科学研究难题，外科干预手段(包括骨折脱位复位、椎管减压、血肿清除等)与药物(如大剂量甲基强的松龙冲击疗法)治疗脊髓损伤的疗效十分有限。随着现代细胞和分子生物学技术的进步，科学家们尝试通过细胞移植的方法将体外培养的细胞植入脊髓损伤处以替代缺失的神经细胞，分泌促进神经再生的神经营养因子，保护神经元减少继发损伤，并与宿主神经系统整合，重建功能性突触，促进脊髓功能恢复，目前已经取得巨大的进展，成为极具前景的脊髓再生手段。

目前用于脊髓损伤修复的种子细胞包括胚胎干细胞、神经干细胞、雪旺氏细胞、嗅鞘细胞、骨髓间充质干细胞等。其中胚胎干细胞、神经干细胞、雪旺氏细胞均不同程度存在取材困难、定向分化不确定、涉及伦理道德等问题，难以应用于临床。骨髓基质干细胞(bonemarrow stromal cells，BMSCs)，又称为骨髓间充质干细胞(mesenchymal stemcells)，来源于中胚层未分化的间充质细胞，具有向多种中胚层组织细胞分化的能力，如分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞等。近年来发现BMSCs具有跨胚层分化的潜力，如分化为内胚层来源的心肌细胞，外胚层来源的神经细胞等。跨胚层分化能力的发现为BMSCs的应用创造了更广阔的前景，BMSCs移植修复中枢神经损伤诸如脑缺血、帕金森病、创伤性脑脊髓损伤的研究已经相继展开。BMSCs具有来源丰富、取材简便、易于体外扩增及能定向诱导分化等特点，且可进行自体移植而避免免疫排斥反应与伦理道德争论，因此通过移植BMSCs治疗SCI已经成为目前脊髓再生研究领域的热点。

尽管未分化与分化的BMSCs均可被用来修复脊髓损伤，但是经诱导预分化的BMSCs可能更适合用于细胞移植，因为BMSCs经预分化后形成的神经样细胞能更好地与脊髓神经损伤部位进行整合，修复病灶，且预分化后的BMSCs处于有丝分裂后期，可减少成肿瘤的几率。

目前用于体外诱导BMSCs向神经细胞分化的方法主要包括化学制剂法与生长因子组合法两种，其主要缺点包括细胞转分化率不高，分化过程中常伴随细胞变性、坏死(常见于化学制剂法)，分化细胞稳定性较差、体外环境下维持时间短(常见于化学制剂法与生长因子组合法)，分化细胞中神经元与神经胶质细胞比例难以控制，因而临床应用价值低。

例如，中国专利申请200810059560.9中公开了一种黄芩苷在促进骨髓间充质干细胞体外定向分化方面的用途及方法，该申请提供了一种用中药单体化合物黄芩苷诱导骨髓干细胞分化的方法，该化合物虽然可以成功诱导干细胞分化但是化学品诱导过程一直备受争议，因为化学物质除了有诱导细胞分化的作用外还有毒素。而且化学制剂法诱导细胞分化过程中常伴随着细胞变性、坏死，细胞分化稳定性差，体外环境维持时间短等缺点。