[发明专利]无抗性筛选双抗原锚定表达载体pLQ2a及制备方法

说明书

本发明公开了无抗性植物乳杆菌锚定表达载体pLQ2a，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示；它是生物安全外源蛋白表达系统，以asd缺失株E.coli 6212/Δasd和alr缺失L.plantarum NC8/Δalr为宿主菌，将来源于乳酸乳球菌（Lactococcus lactis subsp.cremoris strain JM4）基因组上P23启动子作为alr基因表达的启动子，以pYA4545，pYA4545‑Mcherry，pLP‑1261 Inv，pSIP409PgsA’，pSIP409PgsA’‑IL‑10，pSIP409PgsA’‑EGFP为基础载体，构建以PgsA’和LP‑1261为双锚定模型的营养互补筛选标记大肠杆菌‑乳酸菌无抗锚定表达载体pLQ2a，并以EGFP及Mcherry作为报告基因进行筛选及锚定表达验证；解决了植物乳杆菌连接转化效率低，很难筛选到阳性重组子的问题，构建表达载体pLQ2既能在E.coli 6212/Δalr中复制表达，又能在L.plantarum NC8/Δalr中表达。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及植物乳杆菌无抗性筛选双抗原锚定表达载体pLQ2a及制备方法。

背景技术

植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum，L. plantarum）作为一种肠道宿主菌株可耐受胃内低pH值、高盐的环境，最适生长温度为30-37 ℃，能耐受10℃左右的低温，但在45℃以上的环境中出现生长抑制，常见于奶油、肉类、蔬菜等制成的发酵食品并可从多数植物中分离得到，故因此得名。研究表明，植物乳杆菌符合美国食品与药品管理局（FDA）的GRAS（Generally Recognized as Safe）规定以及欧洲食品安全局（EFSA）的安全资格认证（Qualified Presumption of Safety）标准，通常定殖于人和动物的消化道中并发挥益生作用，利用该菌株制成的微生态制剂能够增强机体免疫力，可有效防止一些胃肠道疾病的发生。同时，该菌株也是良好的外源蛋白表达系统，以其作为口服药用蛋白载体很大程度上解决了蛋白易在消化道中发生水解的问题，从而使多种口服药用蛋白都能有效地发挥防治疾病的作用。

pSIP409系列质粒是植物乳杆菌特有的穿梭质粒载体，由于它具备pUC来源于大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli）和256rep来源于植物乳杆菌两个复制子，因此它可以在大肠杆菌中复制并在植物乳杆菌中进行外源蛋白的表达。但该系列质粒载体使用了红霉素抗性基因(erythromycin，EM)作为筛选标记，一旦抗性基因转移到宿主染色体内，很可能产生严重的生物安全隐患，因此该系统潜在的应用价值受到了限制。另外，Nguyen等认为红霉素在酸性条件下会发生降解，这对外源基因的诱导表达造成了不利的影响。红霉素也会使菌体产生“生理应激”，从而影响目的基因表达。所以我们要用非抗生素筛选标记代替该载体的抗生素抗性基因并使改建后载体能在受体菌植物乳杆菌NC8/Δalr（L. plantarumNC8/Δalr）中稳定复制表达外源蛋白，从而使我们的乳酸菌制品达到对机体无害要求。