[发明专利]PRRSV N蛋白的原核可溶性表达方法

说明书

本发明公开了一种PRRSV N蛋白的原核可溶性表达方法及间接ELISA抗体检测方法，PRRSV N蛋白的原核可溶性表达方法包括(1)根据大肠杆菌密码子偏嗜性特征，人工优化并合成PRRSV N蛋白编码基因；(2)以MBP作为促溶标签，构建N蛋白原核表达载体；(3)MBP融合N蛋白表达与纯化；再通过间接ELISA抗体检测方法进行特异性试验。本发明以带有MBP标签的PMAL‑C4X作为表达载体，实现了PRRSV N蛋白在大肠杆菌中的高效可溶性表达，诱导培养在接近室温进行，无需加热或降温设备，目的蛋白洗脱采用10mmoL/L麦芽糖溶液，洗脱效果好，用量少，节约成本。本发明以融合N蛋白为包被抗原建立的间接ELISA抗体检测方法特异性强；本发明建立间接ELISA抗体检测方法与IDEXX同类试剂盒的总符合率为90％左右。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种PRRSV N蛋白的原核可溶性表达方法及间接ELISA抗体检测方法。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS) 是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS virus，PRRSV)引起的一种高度接触性传染病，其能引起母猪繁殖障碍及育肥猪呼吸系统疾病，并伴有轻度神经症状，严重时可造成全身病毒血症。近年来，由于基因重组导致不断有新毒株(例如 NADC30，NADC30-like)出现，使得对PRRS防控的难度增加。根据病毒基因特征和全球范围内流行状况可将PRRSV分为1型(欧洲型)和2型(美洲型)，在我国主要流行的是2型，PRRSV基因组长15.2Kb，含有10个开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)，分别为ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORF3、ORF4、 ORF5、ORF5a、ORF6和ORF7，相邻开放阅读框之间存在短的重叠序列。其中由ORF7编码的核衣壳蛋白N占病毒总蛋白的20-40％，具有强免疫原性，在PRRSV感染猪一周左右即可刺激机体产生特异性抗体，并持续数月之久。所以，N蛋白在PRRSV的流行病学监测和诊断等方面具有重要意义。

由于操作相对简便和制备成本低廉，使得大肠杆菌成为体外表达外源基因的首选系统，但表达的外源蛋白大都是以非可溶性的包涵体形式存在，与天然活性蛋白差距甚远，限制了其应用。目前，原核表达系统中常用的促溶标签有谷胱甘肽S转移酶(GTS)、麦芽糖结合蛋白(MBP)和硫氧还蛋白。其中 MBP是大肠杆菌K12的malE基因编码蛋白，分子量42kDa，研究表明其可以行使分子伴侣的作用，提升蛋白正确折叠率，对难以表达的膜蛋白和某些病毒蛋白都具有很好的促溶作用。此外，MBP能与直链淀粉树脂发生特异性结合，利用麦芽糖竞争性抑制原理可以分离MBP融合蛋白，采用Factor Xa将MBP 标签切除即可获得纯的目的蛋白。虽然MBP标签分子量比较大，但研究表明， MBP表达并不影响目的蛋白生物学性质。PRRSV N蛋白是一种碱性蛋白，局部亲水性较好，通过调整表达条件和添加促溶标签等方式可以实现大肠杆菌的可溶性表达。目前采用MBP作为促溶标签实现N蛋白的原核高效可溶性表达尚鲜有报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种PRRSV N蛋白的原核可溶性表达方法及间接 ELISA抗体检测方法，旨在解决上述背景技术中提出的问题。

本发明是这样实现的，一种PRRSV N蛋白的原核可溶性表达方法，包括如下步骤：

(1)根据大肠杆菌密码子偏嗜性特征，人工优化并合成PRRSV N蛋白编码基因，所述PRRSV N蛋白编码基因序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)以MBP作为促溶标签，构建N蛋白原核表达载体

设计PCR引物，对所述合成的PRRSV N蛋白编码基因进行PCR扩增，所述引物序列如下：

上游引物为F：5'-CGGAATTCATGCCAAATAACAACGGCAAG-3'，下划线为EcoRⅠ酶切位点；