[发明专利]一种用于检测溶血性曼氏杆菌实时荧光PCR引物

说明书

本发明提供一种用于SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测溶血性曼氏杆菌的引物，所述引物序列为上游引物：5’‑AAGCCGTGGTTGATACTATT‑3’，下游引物：5’‑CCGCCTGCCATTACTAAG‑3’。本发明根据GenBank登录的AY839679的gcp基因序列，设计特异性引物，首次建立溶血性曼氏杆菌gcp基因的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法，该方法特异性好、灵敏度高、重复性好。

技术领域

本发明涉及一种用于溶血性曼氏杆菌SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测引物，属于分子生物学领域。

背景技术

溶血性曼氏杆菌是一种可感染多种家畜和野生动物的条件致病菌，主要感染牛、羊等反刍动物。该菌是牛、羊肺炎及新生羔羊败血症的主要病原，已经严重危害养羊业的健康发展，全球每年约有30%的病死牛与该菌有直接或间接关系，仅北美国家导致的经济损失超过10亿美元。

目前对溶血性曼氏杆菌的病原学诊断技术方面，国内外已有细菌分离鉴定法和普通PCR方法的报道，虽有关于曼氏杆菌属特异性的荧光定量PCR方法，然未见有溶血性曼氏杆菌gcp基因SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法的报道。细菌分离鉴定法存在耗时较长，且感染早期经抗生素治疗后分离更加困难，并且动物体内多种细菌如多杀性巴氏杆菌、海藻巴氏杆菌等均能抑制该菌的生长，使其分利率远低于实际感染率。普通PCR存在敏感性和特异性较低等缺点，使其在实际应用中受到一定的限制。SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR是在普通PCR的基础上，在反应体系中加入荧光染料，利用荧光PCR检测仪来检测靶核苷酸序列的技术，具有特异性强、定量准确、灵敏度高等优点。通过查阅文献发现，当前国内外尚未有针对溶血性曼氏杆菌gcp基因的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法。本发明的建立可以填补该领域的空白。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测溶血性曼氏杆菌的实时荧光PCR引物。

为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种用于溶血性曼氏杆菌gcp基因的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测引物，引物的核苷酸序列为：

上游引物：5’- AAGCCGTGGTTGATACTATT -3’，

下游引物：5’- CCGCCTGCCATTACTAAG -3’。

利用本发明的引物可用于对溶血性曼氏杆菌的gcp基因进行检测，尤其适用于SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR技术的检测。通过对反应体系和反应条件的各种优化，建立了一套可用于检测溶血性曼氏杆菌gcp基因的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法。

具体操作方法如下：

1、引物设计：根据GenBank上公布的溶血性曼氏杆菌AY839679基因组序列，利用BeaconDesigner 7.9 软件对gcp基因序列进行引物设计，采用BLAST工具进行检索，初步验证其特异性。

2、反应体系的优化：优化出的25μL最佳反应体系为：SYBR Premix Ex Taq 2×12.5μL、上、下游引物（20 μmol/L）各1.0μL、模板2μL、水补足至25μL。最佳反应条件为：95℃，30s 预变性；95℃，5s，58℃，15s，72℃，20s，共40 个循环。

3、阳性标准品的制备：取1 mL溶血性曼氏杆菌培养液加入1.5 mL离心管中，10000r/min离心3min，弃上清收集菌体，使用生工组织DNA提取试剂盒提取DNA，利用蛋白质核酸仪测定其浓度，换算成拷贝数，作为阳性标准品备用。

4、标准曲线的建立：以优化的反应体系进行PCR扩增，以拷贝数为横坐标，以Ct值为纵坐标建立标准曲线，判断阳性的标准。