[发明专利]一种单细胞RNA测序文库构建方法

权利要求书

1.一种单细胞RNA测序文库构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)向单细胞裂解体系中加入carrier RNA，以实现建库RNA的量，且无需对全长cDNA进行预扩增；

(2)利用商品化试剂盒或RNA测序文库构建方法以构建文库；

(3)剔除文库中由carrier RNA转录而来的DNA；

(4)进行高通量测序；

其中所述carrier RNA序列中的每50个碱基序列都不能与测序物种的基因组相匹配；或对于不足50个碱基的carrier RNA的全长序列不能与测序物种的基因组相匹配。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的carrierRNA包括含有3’端多聚腺苷酸尾的carrier RNA；不含有3’端多聚腺苷酸尾的carrier RNA；5’端磷酸化Small carrier RNA；或带有修饰的carrier RNA。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的carrierRNA包括含有m6A修饰、m1A修饰、m7G修饰或biotin修饰的carrier RNA。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的carrierRNA包括直接化学合成的carrierRNA，或是通过含有T7启动子的DNA模板体外转录获得的carrierRNA，其长度范围为10-10000nt；或在small RNA文库构建过程中加入的含有5’端磷酸化的small RNAcarrier。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述通过含有T7启动子的DNA模板体外转录获得的carrierRNA，其长度范围为150-300nt。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)所述单细胞裂解体系包括单个或小于100ng的细胞RNA或总RNA量小于100ng的单细胞裂解体系。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中加入的carrier RNA量的范围为5ng–1μg以实现步骤(2)中利用商品化试剂盒或RNA测序文库构建方法进行构建文库。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中加入的carrier RNA量的范围为100ng-1μg。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中所述商业化试剂盒包括用于mRNA文库构建的NEB E7490和E7530或诺唯赞Vazyme NR601；用于链特异性文库构建的NEB E7420或诺唯赞Vazyme NR602；或用于small RNA文库构建的NEB E7300。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中所述RNA测序文库构建方法包括PolyA RNA文库构建，链特异性RNA文库构建或small RNA文库构建方法。

11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)剔除包括：利用carrier上的限制性酶切位点进行酶切剔除，或使用具有CRISPR-Cas9识别的sgRNA酶切位点的carrierRNA对其进行cas9核酸酶体外切除或基于捕获剔除理念的方法比如biotin-streptavidin结合，或探针杂交方法进行捕获剔除。

12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中进一步包括：剔除DNA之后使用AmpureXP beads或同类型beads进行纯化。