[发明专利]一种非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒、制备方法及使用方法

权利要求书

1.一种非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，包括ASFV-反应液、DNA酶混合液、ASFV-内标、ASFV-阳性对照、ASFV-阴性对照、核酸释放剂以及ASFV-定量参考品；

其中，所述ASFV-反应液包括：

引物：ASF03F03：5’-GATGATGATTACCTTYGCYTTG-3’和ASF03R03：5’-CAACTAATATAAAAYTCTCTTGCTCT-3’；

内标引物：IPC05F01：5’-CATAGTTGGACCGCTAGGA-3’和IPC05R01：5’-GAAAGGTCCCGCAAAGAGT-3’；

探针：ASF03P：5’-Fam-CCACGGGAGGAATAYCAAC-Mgb-3’，Fam为报告荧光基团，Mgb为淬灭荧光基团；

内标探针：IPC05P：5’-Hex-CCGGTGATAAACCTTTGGACCCT-Bhq1-3’，Hex为报告荧光基团，Bhq1为淬灭荧光基团；

所述引物和探针对应于非洲猪瘟病毒p72基因的高度保守片段，所述非洲猪瘟病毒p72基因的高度保守片段的扩增目标核苷酸序列为:GATGATGATTACCTTTGCTTTGAAGCCACGGGAGGAATATCAACCCAGTGGTCATATTAACGTATCCAGAGCAAGAGAATTTTATATTAGTTG；

所述ASFV-内标的核苷酸序列为CTGGAGACTGAGGGTTGACGCGCATTCGTCATTGAACGCAGACACGGCTGAGAGAACATGGAGCGACTGCACTGCACTTGGTCGATCTGATTAGGAGTGGGGTTTATGCCCGCGGCTTATCCCCCTATCCTTGCGACACGGGAGAAGACAGATTGTCATCGATTTCGCAAGCCATGATATGTTTGGCCCGACCAACCGCGTTTTTCTCGCGCTTGGATAACGACCTATGGTGTGGACAGTGGCTTAGAGGACATGACACGACGGGCTGAAAGTATGTGGTGCTGGGGCCCTTAGATAGCTGCATAGTTGGACCGCTAGGAATTATATCAATTCGAGATCTCCAGCCGACAAAGTAGGCTCCTAACTAACAGGGTCCAAAGGTTTATCACCGGTCCTTACTCTTTGCGGGACCTTTCTACCCATACAATATCGTCCTCCGATGATGGATCACGGAG。

2.根据权利要求1所述的非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述ASFV-反应液还包括缓冲液，所述缓冲液中，盐酸缓冲液的浓度为125～200mM。

3.根据权利要求1所述的非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述ASFV-反应液还包括脱氧核糖核苷，包括dATP、dUTP、dGTP以及dCTP。

4.根据权利要求1所述的非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述核酸释放剂包括25～100mM的氢氧化钠、1～5％的聚乙二醇和0.5～1mM的乙二胺四乙酸二钠。

5.根据权利要求1所述的非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述DNA酶混合液包括酶稀释液、热启动Taq酶与尿嘧啶-N-糖基化酶。

6.根据权利要求1所述的非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述ASFV-定量参考品包括4个浓度逐渐降低的重组质粒，所述重组质粒的核苷酸序列包括:GATGATGATTACCTTTGCTTTGAAGCCACGGGAGGAATATCAACCCAGTGGTCATATTAACGTATCCAGAGCAAGAGAATTTTATATTAGTTG。

7.根据权利要求1所述的非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒中，各组分的含量为：