[发明专利]一种高淀粉含量谷物籽粒剖析及内部结构观察的方法

说明书

本发明公开了一种高淀粉含量谷物籽粒剖析及内部结构观察的方法，属于高淀粉含量谷物籽粒剖析技术领域。包括固定、漂洗、脱水、包埋、渗透、切片、取片、成像前处理、染色、观察等步骤，操作简单、效率高、组织形态保持完整，内部组分区分度高，可观察到紧实的谷物籽粒的内部结构，适用于高淀粉含量谷物籽粒内部结构剖析，尤其适用于收获后水分含量较低、结构紧实、籽粒坚硬的谷物。

技术领域

本发明涉及一种高淀粉含量谷物籽粒剖析及内部结构观察的方法，属于高淀粉含量谷物籽粒剖析技术领域。

背景技术

切片技术是动、植物样本进行内部显微结构观察的常用手段。对于动物组织样本进行切片、染色为开展病理学、免疫组化及原位杂交等方面研究提供了技术保障。此外，随着植物生态学和育种技术的不断发展，切片技术广泛的应用于植物育种、鉴别及植物形态建立的研究，成为植物科学研究领域的重要手段，因此，组织切片品质的优良对动、植物组织化学的研究具有重要的意义。

谷物是地球上最主要的粮食作物，目前有关切片技术在谷物方面的应用主要集中在遗传育种、栽培及环境、生理生化等方面且取得了巨大的进展，但对于指导谷物的加工及品质判定贡献较少。随着人们对谷物研究的不断深入，籽粒内部的结构与谷物的品质特性之间的相关性成为研究重点。谷物籽粒的发育通常需经历生长期、灌浆初期，乳熟期，蜡熟期和完熟期，随着谷物的发育，籽粒中的主要贮藏物质淀粉和蛋白质组间不断进行积累，胚乳由液态逐渐发育成质地紧密的固态。常规的谷物组织分析主要基于灌浆早期的籽粒切片，由于初期籽粒水分含量高，质地松软，有利于固定液及包埋液的渗透，因而比较容易切片。但随着籽粒的进一步发育，籽粒内部水分将会逐渐减少，淀粉体、蛋白体不断积累并紧密的充实在籽粒内部，使得固定剂、包埋剂很难渗透。同时，因籽粒内部较高含量的淀粉，使得籽粒在较长的脱水过程中粘结性下降，坚硬易碎。同时，籽粒内部因组分分布十分致密，常规的组织染色方法很难将不同组分有效的区分开。因此，一直难以实现高淀粉含量成熟籽粒内部结构的剖析。

目前较为常用的切片方法是石蜡切片法及树脂切片法。Ogawa等人报道了大米颖果石蜡切片的方法，但所述方法步骤较多，且组分间区分度不高。专利CN105547793A公布了一种玉米成熟种子的石蜡切片方法，专利CN104374601A公布了一种谷物成熟种子树脂切片的方法，本方法也以石蜡作为包埋剂切片，但与传统的石蜡切片法有很大的不同：传统切片法所用石蜡一般融化温度在60-70℃之间，且固定、包埋、渗透、烘片均在较高的温度下，而对于高淀粉含量谷物籽粒来说，较高的温度会使淀粉糊化，从而影响谷物籽粒的原始结构。另一方面，传统切片法主要基于水分含量较高的植物组织，如Liuqiaoquan等人报道了颖果的切片方法，因而固定及渗透时间均较长，而对于成熟且粉体含量较高的样品，较长的固定及后处理时间会使得样品十分坚硬，且易破裂，切片时易碎，尤其是在较长的梯度酒精脱水过程中，因此，很难获得完整的籽粒截面。树脂切片法因树脂渗透性佳的特点近年来开始应用于籽粒的结构分析，但是因树脂成本较高，且同样存在切片易碎、处理温度高、周期长、干扰荧光观测等缺点而受到了限制。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种高淀粉含量成熟谷物籽粒剖析及内部结构观察的方法，不仅缩短了制片的时间、有效的保存了籽粒内部组分的原始结构、提高了切片效率，还通过干法展片及不同染色方法实现了区分度较高的结构剖析。可运用于高淀粉谷物籽粒内部结构的剖析，进而指导谷物的加工及控制。

本发明的第一个目的是提供一种高淀粉含量成熟谷物籽粒的预处理方法，所述方法包括水分平衡、固定、脱水、浸蜡、包埋、切片和展片；所述水分平衡是将谷物籽粒的水分调节至14～20％；所述脱水，是将固定后的籽粒干燥至水分含量为5％以下；所述浸蜡是在30～50℃环境下进行。

在本发明的一种实施方式中，所述谷物包括玉米、小麦、大麦、藜麦、大米、小米、绿豆、红豆、大豆等淀粉含量在40％以上的谷物。