[发明专利]F型三系杂交小麦雄性不育基因相关分子标记开发及应用

权利要求书

1.一种F型三系杂交小麦雄性不育基因相关SNP位点的特异PCR标记开发方法，所述方法包括：

(1)将小麦通过多代姊妹交，将获得的自交系分成自交结实率高的保持系和自交结实率中等的保持系，以及自交结实率低于5％的稳定不育系，三者除育性差异，其他生物学特征完全一致；

(2)对上述三个样品进行建库测序：提取上述三个样品的基因组DNA，建库后进行测序；

(3)基因组序列比较分析：比对小麦参考基因组数据库中线粒体及细胞核参考基因组序列，检索三个样品线粒体及细胞核基因组间存在的SNP变异；

(4)F型雄性不育基因相关SNP位点特异PCR标记开发：针对上述不育系与不同自交结实率的保持系株系间鉴定获得的线粒体及细胞核基因组SNP位点，检测、设计和开发限制性内切酶扩增多态性序列(CAPS)标记或竞争性等位基因特异性PCR(KASP)标记。

2.根据权利要求1所述的方法，所述多代是指8代以上。

3.根据权利要求1或2所述的方法，通过Hiseq2000进行测序。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，运用BWA软件与小麦参考基因组序列进行比对，并利用GATK软件包进行SNP信息的检测和注释。

5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，利用Annovar程序结合参考基因组的gff注释信息对得到的纯合SNP进行注释，并通过Goatools进行富集分析，利用KOBAS进行KEGGpathway富集分析。

6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，通过DNAMAN和Primer Premier5.0检测、设计和开发限制性内切酶扩增多态性序列标记或竞争性等位基因特异性PCR标记。

7.根据权利要求1-6任一项的方法获得的F型三系杂交小麦雄性不育基因相关SNP位点分子标记，所述SNP位点包括3个SNP位点，第1个SNP位于358137bp为PsaA/PsaB基因内同义突变C变成T，第2和3个SNP分别位于419226bp和419241bp为NdhB基因内非同义突变T变成C。

8.根据权利要求7的F型三系杂交小麦雄性不育基因相关SNP位点分子标记的检测方法，所述方法包括：

用以下引物进行PCR扩增：正向引物：5’GCATAACGGCCCTATTGTTCC3’；反向引物：5’CGAACGAACCACACTCCTTC3’；

用限制性内切酶对PCR产物酶切，所用限制性内切酶为Bsp1407I。

9.根据权利要求8所述的方法，PCR扩增退火温度Tm＝59℃，延伸时间40S。

10.根据权利要求8或9所述的方法，酶切在37℃下进行。