[发明专利]一种检测猪脾转移因子和猪繁殖与呼吸综合征病毒活疫苗联合免疫效果的方法

权利要求书

1.一种检测猪脾转移因子和猪繁殖与呼吸综合征病毒活疫苗联合免疫效果的方法，其特征在于：其包括以下步骤：

1）取猪繁殖与呼吸综合征病毒活疫苗原液，用含1.8-2.2%新生牛血清、0.8-1.2%青霉素-链霉素双抗的完全DMEM培养基稀释至含200 TCID₅₀的病毒液；

取猪脾转移因子，用含1.8-2.2%新生牛血清、0.8-1.2%青霉素-链霉素双抗的完全DMEM培养基稀释将多肽含量稀释至1 mg/mL；

2）在含8-12%新生牛血清、0.8-1.2%青霉素-链霉素双抗的完全DMEM培养基中将细胞培养至单层；

3) 取步骤2)中的单层细胞，用含8-12%新生牛血清、0.8-1.2%青霉素-链霉素双抗的完全DMEM培养基稀释，调整细胞浓度为2~3×10⁵个/mL，将稀释后的细胞接种于细胞培养板中，继续培养；形成细胞单层后用磷酸盐缓冲液洗涤细胞板，去除培养基；

4）将步骤1）稀释后的病毒液以及稀释后的猪脾转移因子上样于步骤3）的细胞培养板中，并培养孵育细胞；上样量为100 μL/孔，具体如下：

含1.8-2.2%新生牛血清、0.8-1.2%青霉素-链霉素双抗的完全DMEM培养基35-45μL ；

病毒液20-30μL；

猪脾转移因子30-40 μL；

5) 将步骤4）孵育的细胞用MTT溶液进行反应，继续孵育；

6) 将步骤5）孵育的细胞用二甲基亚砜进行溶解处理；

7）将步骤6）处理后的细胞板放置于酶标仪中测量OD值，测定细胞活性。

2.根据权利要求1所述的一种检测猪脾转移因子和猪繁殖与呼吸综合征病毒活疫苗联合免疫效果的方法，其特征在于：步骤1）中，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒活疫苗为CH-1R株。

3.根据权利要求1所述的一种检测猪脾转移因子和猪繁殖与呼吸综合征病毒活疫苗联合免疫效果的方法，其特征在于：步骤2）中，所述细胞为pk-15细胞。

4.根据权利要求1所述的一种检测猪脾转移因子和猪繁殖与呼吸综合征病毒活疫苗联合免疫效果的方法，其特征在于：步骤3）中，所述细胞培养板为96孔细胞培养板。

5.根据权利要求1所述的一种检测猪脾转移因子和猪繁殖与呼吸综合征病毒活疫苗联合免疫效果的方法，其特征在于：步骤3）中，细胞稀释的具体步骤如下：将步骤2)中的单层细胞用磷酸盐缓冲液洗2-3次，然后加入胰酶消化液使其布满所有细胞表面，于37℃放置数分钟，然后弃去消化液，用含8-12%新生牛血清、0.8-1.2%青霉素-链霉素双抗的完全DMEM培养基将细胞洗脱，将洗脱后的细胞悬液进行稀释，调整细胞浓度为2~3×10⁵个/mL。

6. 根据权利要求1所述的一种检测猪脾转移因子和猪繁殖与呼吸综合征病毒活疫苗联合免疫效果的方法，其特征在于：步骤3）中，稀释后的细胞培养条件为：细胞接种量100 μL/孔，在36.5-37.5℃、4.5-5.5 % CO₂条件下培养18-24 h形成细胞单层。

7.根据权利要求1所述的一种检测猪脾转移因子和猪繁殖与呼吸综合征病毒活疫苗联合免疫效果的方法，其特征在于：步骤4）中，上样量具体如下：

含1.8-2.2%新生牛血清、0.8-1.2%青霉素-链霉素双抗的完全DMEM培养基40μL ；

病毒液25μL；

猪脾转移因子35 μL。

8. 根据权利要求1所述的一种检测猪脾转移因子和猪繁殖与呼吸综合征病毒活疫苗联合免疫效果的方法，其特征在于：步骤4）中，培养孵育细胞的条件为在36.5-37.5℃、4.5-5.5 % CO₂条件下培养40-48 h 。

9.根据权利要求1所述的一种检测猪脾转移因子和猪繁殖与呼吸综合征病毒活疫苗联合免疫效果的方法，其特征在于：步骤5）中，细胞继续孵育的时间为3.5-4.5h。

10.根据权利要求1所述的一种检测猪脾转移因子和猪繁殖与呼吸综合征病毒活疫苗联合免疫效果的方法，其特征在于：步骤7）中，于480-500nm波长处测量OD值。