[发明专利]一种新的基因组甲基化文库的构建方法和应用

权利要求书

1.一种甲基化测序文库的构建方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

(a)提供一待测样本，将样本中的DNA打断，从而得到片段化DNA；

(b)将所述片段化DNA的5′-磷酸基团去除，从而得到5′去磷酸化DNA；

(c)对所述5′去磷酸化DNA进行补平反应，从而得到5′去磷酸化的平末端DNA；

(d)将所述平末端DNA与具有茎环结构的第一衔接子进行连接反应，从而得到第一连接产物；

(e)利用5-methyl-dCTP，以第一连接产物的一条单链为模板进行扩增反应，从而得到第一扩增产物；和

(f)利用所述的第一扩增产物得到甲基化测序文库；

其中，所述的第一扩增产物包含：

(i)具有从5′到3′的式A结构的第一扩增产物A，和

(ii)具有从5′到3′的式B结构的第一扩增产物B，

S_a-L-S_bm (A)

S_b-L-S_am (B)

式中，

各“-”独立地为键；

S_a为所述第一连接产物的一条单链；

S_b为所述第一连接产物的一条单链，且S_b的序列与S_a的序列反向互补；

S_am以S_b为模板合成，S_am为S_b的互补链，且S_am中的碱基C均为甲基化碱基C；

S_bm以S_a为模板合成，S_bm为S_a的互补链，且S_bm中的碱基C均为甲基化碱基C；

L为第一衔接子。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的第一衔接子具有从5′到3′的式C结构：

L₁-L₀-L₂ (C)

式中，

各“-”独立地为键；

L₁和L₂为核苷酸连接序列，且L₁和L₂互补；

L₀为长度为4-20bp的间隔序列。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的L₁中的碱基C均为未甲基化的碱基C，且L₂中的碱基C均为甲基化碱基C；

较佳地，所述的第一衔接子的5′端有磷酸化修饰，且3′端没有磷酸化修饰；

更佳地，所述的第一衔接子的序列如SEQ ID NO.:1所示。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(f)还包括步骤：

(1)利用重亚硫酸盐处理，将第一扩增产物中未甲基化的碱基C转换为碱基U，从而得到第一转换产物；和

(2)将第一转换产物与第二衔接子进行连接反应，从而得到甲基化测序文库，其中，所述的第二衔接子为Methyl-Seq DNA Library Kit(Swift30024)中提供的Adapter 1和Adapter 2。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(f)还包括步骤：

(I)将第一扩增产物与第三衔接子进行连接反应，从而得到第三连接产物，其中，所述的第三衔接子具有环形结构，且环形结构中带有碱基U，较佳地所述的第三衔接子为NEBNext Methylated Adaptor，；

(II)利用重亚硫酸盐处理，将第三连接产物中未甲基化的碱基C转换为碱基U，从而得到第二转换产物；和

(III)对第二转换产物进行扩增反应，从而得到甲基化测序文库。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述片段化DNA的长度为150～180bp。