[发明专利]一种检测猪脾转移因子与猪瘟活疫苗联合免疫效果的方法

说明书

本发明提供了一种检测猪脾转移因子与猪瘟活疫苗联合免疫效果的方法，包括以下步骤：1）细胞培养；2）细胞接种，控制细胞密度；3）将猪瘟活疫苗与猪脾转移因子上样于细胞培养板中，培养孵育细胞；4）将细胞用MTT溶液进行反应，继续孵育，然后用DMSO进行溶解处理，最后将细胞板放置与酶标仪中测量OD值，计算细胞活性。本发明方法具有检测背景低、灵敏度高、专属性强、准确度高、重复性好等优点，尤其适用于猪脾转移因子和猪瘟活疫苗联合免疫时生物活性的检测及质量标准的建立。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测猪脾转移因子与猪瘟活疫苗联合免疫效果的方法。

背景技术

转移因子（Transfer Factor，TF）能调节动物机体免疫功能，协同疫苗免疫，缩短疫苗免疫应答期，提高动物免疫水平，具有非常广阔的应用前景。转移因子是存在于人和动物白细胞中的可透析小分子物质，能将供体所具有的细胞免疫功能转移给受体，从而非特异性地增强受体的免疫功能。转移因子的成分主要包括低聚核苷酸和多肽，能诱导机体免疫细胞活化，增强机体免疫力，能转移包括病毒、细菌、寄生虫、真菌、组织相容性抗原和肿瘤抗原等多种抗原的细胞免疫。此外，转移因子具有分子质量小、无毒、无抗原性、不引起过敏反应、不产生对抗抗体且可超越种系界限应用等优点。

由于转移因子使用安全、作用迅速、效果显著、无药物残留、无抗原性、无毒副作用，且来源广，同时，其作为免疫激发剂和辅助制剂，可显著提高对动物疾病的防控效果，市场认可度逐渐提高。因此，转移因子在兽医临床领域，将逐步地释放其应用优势，转移因子产品的开发与应用将对畜牧业的发展具有十分重要的现实意义。

猪瘟俗称烂肠瘟是一种具有高度传染性疫病，是威胁养猪业的主要传染病之一，其特征是：急性，呈败血性变化，实质器官出血，坏死和梗死；慢性呈纤维素性坏死性肠炎，后期常有副伤寒及巴氏杆菌病继发。该病主要通过直接接触，或由于接触污染的媒介物而发病。消化道、鼻腔粘膜和破裂的皮肤均是感染途径。一年四季都可发生，以春夏多雨季节为多。

大量的试验研究表明， 转移因子对猪瘟活疫苗具有协同作用，能显著提高机体细胞免疫水平，缩短机体免疫应答期，促进抗体的产生，并延长抗体高峰期，使之维持更长的时间。但目前检测转移因子与猪瘟活疫苗联合使用效果的主要通过检测抗体及细胞因子来展现，检测成本高、周期长且生物体个体差异大，检测结果较不稳定。因此建立一种快速、方便、检验成本低且检验结果相对稳定的检测猪脾转移因子与猪瘟活疫苗联合免疫效果的方法具有重要意义。

发明内容

本发明目的在于提供一种在细胞上展现的、检验成本低且检验结果相对稳定的检测猪脾转移因子与猪瘟活疫苗联合免疫效果的方法

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种检测猪脾转移因子与猪瘟活疫苗联合免疫效果的方法，其包括以下步骤：

1）取猪瘟活疫苗原液，用含1.8-2.2%新生牛血清、0.8-1.2%青霉素-链霉素双抗的完全DMEM培养基稀释至含100 RID的病毒液；

取猪脾转移因子，用含1.8-2.2%新生牛血清、0.8-1.2%青霉素-链霉素双抗的完全DMEM培养基稀释将多肽含量稀释至1 mg/mL；

2）在含8-12%新生牛血清、0.8-1.2%青霉素-链霉素双抗的完全DMEM培养基中将细胞培养至单层；

3) 取步骤2)中的单层细胞，用含8-12%新生牛血清、0.8-1.2%青霉素-链霉素双抗的完全DMEM培养基稀释，调整细胞浓度为2~3×10⁵个/mL，将稀释后的细胞接种于细胞培养板中，继续培养；形成细胞单层后用磷酸盐缓冲液洗涤细胞板，去除培养基；

4）将步骤1）稀释后的病毒液以及稀释后的猪脾转移因子上样于步骤3）的细胞培养板中，并培养孵育细胞；上样量为100 μL/孔，具体如下：