[发明专利]一种利用构巢曲霉发酵高产棘白菌素B的方法

说明书

本发明公开了一种利用构巢曲霉发酵高产棘白菌素B的方法，所述方法为：将构巢曲霉接种至发酵培养基，在25℃下培养，获得含棘白菌素B的发酵液，将发酵液分离纯化，获得棘白菌素B；通过优化碳源种类、添加微粒等方式控制构巢曲霉发酵过程中的菌丝体形态，使菌丝体呈现小球状，使发酵中因菌丝体长度过长导致的粘度高、溶氧低、传质不充分等问题得到解决；通过分析ECB合成过程中关键代谢组分，优化发酵过程中的前体添加策略，使发酵产物产量进一步提高一倍以上，具有很好的应用前景。

(一)技术领域

本发明涉及一种利用构巢曲霉发酵高产棘白菌素B的方法。

(二)背景技术

丝状真菌发酵过程中，其菌丝形态受生长条件及培养环境的影响，随着培养条件、培养基组成等的变化，菌丝形态会出现不同的类型，如无分支的菌丝、有分支且结构复杂的菌丝、菌丝团块、菌丝球等，表现出不同大小、密度及表面结构。此外，随时间变化，不同生长时期的菌丝体内部结构也会发生改变。丝状真菌在液体深层发酵中菌丝体通常呈现絮状、团状和球状三种形态。菌丝体形态对发酵液的粘度等影响较大，菌丝体形态不同，其产物也会发生改变，因此，在丝状真菌发酵过程中需要将其控制在最佳菌丝体形态，以利于目标产物的代谢合成。

在发酵生产过程中，丝状真菌菌丝若形成絮状的菌丝体，会造成发酵液粘度增大，不利于营养物质和氧气的溶解、传递及分布，从而降低好氧发酵产物的产量，严重时会导致产物产率极低；若菌丝体形态呈现紧密的团块状，在团块内部，营养物质及氧气传递受阻，会导致内部出现营养匮乏及缺氧状态，影响菌丝体生长和产物合成，有时还会造成团块内部菌丝体发生自溶现象。深层液体发酵的孢子萌发出菌丝及菌丝延长的过程中，在孢子聚集及机械搅拌作用下，发酵液中的菌丝还可以形成大小适中的菌丝球，此时发酵液的传递效果好，菌丝体生长旺盛，目标代谢产物合成效率高。可以说菌丝体形态是工业发酵中获得目标产物产量最大化的主要影响因素。

目前国内外棘白菌素B(ECB)均是利用微生物发酵法进行制备，其中主要是以构巢曲霉Aspergillus nidulans进行发酵。但是该类微生物发酵过程中会碰到一些难以克服的技术问题，如发酵液粘度过高，供养不足以及传质受阻等，这些问题都会导致菌种代谢合成产物的能力下降，因此ECB发酵仍然处于实验研究阶段。要解决上述问题，常用的方法有菌种诱变、培养基优化、气升式发酵罐培养、细胞固定化以及工艺操作条件调控等。近年来，研究学者提出了通过改变发酵培养基成分以及添加外源无机微粒的方式影响丝状微生物生长过程中的菌体形态，并进一步影响产物产量及酶的活性，因此选择合适的方法改变棘白菌素B菌株发酵过程中的菌体形态对实现棘白菌素B发酵生产具有较大的社会和经济效益。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种利用构巢曲霉发酵高产棘白菌素B的方法，提供一种控制构巢曲霉发酵菌株A.nidulans ZJB 09223菌体形态的发酵培养基，以克服棘白菌素B发酵过程中发酵液粘度过高，溶氧传质受阻的缺陷，然后对该培养基进行前体氨基酸添加的优化，进一步提高棘白菌素B发酵产量。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种利用构巢曲霉发酵高产棘白菌素B的方法，所述方法为：将构巢曲霉接种至发酵培养基，在25℃下培养，获得含棘白菌素B的发酵液，将发酵液分离纯化，获得棘白菌素B；所述发酵培养基终浓度组成为：碳源54～134g/L，氨基酸0.1～12g/L，蛋白胨8.6g/L，黄豆饼粉40.0g/L，花生油20.0g/L，K₂HPO₄·3H₂O 3.2g/L，CaCl₂ 0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，FeSO₄·7H₂O 0.5g/L，MnSO₄·H₂O 0.2g/L，CuSO₄·5H₂O 0.6g/L，溶剂为蒸馏水，pH值6～6.8，所述碳源为甘露醇、葡萄糖、甘油或油酸甲酯。