[发明专利]一种基于药物靶点停留时间的细胞洗脱方法

说明书

一种基于药物靶点停留时间的细胞洗脱方法，其方法特征是将待测化合物与表达有药物靶点的细胞充分孵育，通过重复三次洗脱、孵育、离心步骤，不断移除从药物靶点解离的待测化合物，随后使用细胞功能实验，检测经洗脱后，未从药物作用靶点解离的化合物所产生功效，所得结果与同等浓度的待测化合物和表达有药物靶点的细胞充分孵育后，未经洗脱、孵育、离心步骤，所产生的功效进行对比，分析所测化合物停留时间的长短。该细胞洗脱实验方法具有无污染，高通量，操作简单等特点。

技术领域

本发明涉及一种细胞洗脱方法，尤其是涉及一种基于药物靶点停留时间的细胞洗脱方法。

背景技术

药物靶点停留时间是一项近年来新兴的药理学概念。此项分子结合动力学指标反映了药物与其作用靶点结合后，两者形成复合体的存在时间。测定药物与靶点结合的分子动力学特征，在早期的药物设计与筛选过程中具有重要的意义。已有研究结果显示，优化药物在作用靶点上的停留时间，能够改善药物的临床药效，减少药物的副作用。因此，开展基于药物靶点停留时间的先导化合物筛选与优化，可能为创新药物的设计与发现提供新的依据，而建立快速、有效，基于药物靶点停留时间的筛选方法，能为先导药物的设计与优化提供新的手段。

目前，国内外对于药物靶点停留时间的研究，已经取得了一定的进展，包括一系列检测方法的建立，这其中包括对待测化合物进行放射性同位素标记后，利用放射性同位素配体结合速率实验和离解速率实验，测量其在药物靶点上的结合速率和离解速率，从而得到其靶点停留时间；或者将未标记的待测化合物与放射性同位素标记的标准物和药物靶点共同孵育，进行竞争结合，利用竞争结合模型计算待测化合物停留时间。然而，这些方法存在着一定的局限性。首先，现有的方法需要使用放射性同位素标记的化合物，要求开展相关实验的场地和操作人员具有相应的资质，因此限制了此方法开展的广泛性。其次，使用上述方法对化合物进行分子动力学检测，需要通过测定一系列时间点下的数值，计算药物靶点停留时间，这样并不便于对一系列未知的化合物进行快速、高通量的筛选。因此，在早期的药物研究与筛选过程中，迫切的需要在筛选方法上进行更新。

发明内容

为了克服现有检测方法操作不便、筛选通量低，以及对放射性同位素标记配体的依赖等问题，本发明提供了基于药物靶点停留时间的细胞洗脱方法，用于筛选具有不同药物靶点停留时间的化合物。该方法无需使用放射性同位素标记的配体，能够对一系列未知的化合物进行快速、高通量的筛选，具有无污染，操作简单等优点。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：该一种基于药物靶点停留时间的细胞洗脱方法为：

(1)收集表达药物靶点的稳转细胞或者组织分离的内源性细胞，等分成两份，分别标记为a组、b组；

(2)将a组细胞置于细胞洗脱实验反应缓冲液中，加入过量的待测化合物，在37℃下孵育1小时，使该待测化合物与细胞上表达的药物靶点充分结合；孵育1小时后，将所得细胞混合物转移至离心管中，在4℃下离心3分钟，转速设定为300×g；离心结束后，弃除上清液，以分离未与细胞上药物靶点结合的化合物；分离结束后，加入洗脱实验反应缓冲液，反复吹打分散离心管底部的细胞，充分混匀后在37℃下孵育10分钟，促进待测化合物从药物作用靶点上的解离过程；孵育结束后，将孵育后的细胞混合物再次转移至离心管中，在4℃下离心3分钟，转速设定为300×g，离心结束后弃去上清液，移除经洗脱从药物作用靶点上解离的化合物；重复上述细胞洗脱步骤，包括：吹打分散离心后的细胞、加入细胞洗脱实验反应缓冲液孵育、离心洗脱移除从药物作用靶点上解离的化合物，共计3次；向洗脱后的细胞中，加入细胞功能实验反应缓冲液，在37℃下孵育1小时后，检测细胞功能水平。

(3)将b组细胞置于与步骤(2)中相同的细胞功能实验反应缓冲液中，加入与步骤(2)中同等浓度的待测化合物，在37℃下孵育1小时后，检测细胞功能水平。

(4)比较上述步骤(2)和步骤(3)中所测细胞功能学水平的差异，具有较短停留时间化合物两组数值差异较大；具有较长停留时间化合物两组数值差异较小。