[发明专利]一种基于无缝克隆技术的克隆载体制备方法以及试剂盒在审
| 申请号： | 201810163345.7 | 申请日： | 2018-02-27 |
| 公开（公告）号： | CN108486140A | 公开（公告）日： | 2018-09-04 |
| 发明（设计）人： | 庞一林;谭国强;吕建新;李江辉;李唐;张涛;孙倩倩;韩琴霞 | 申请（专利权）人： | 温州医科大学 |
| 主分类号： | C12N15/70 | 分类号： | C12N15/70;C12N15/66 |
| 代理公司： | 温州匠心专利代理事务所(特殊普通合伙) 33279 | 代理人： | 胡仁勇 |
| 地址： | 325000 浙江省温州市瓯海*** | 国省代码： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 克隆载体 制备 阳性克隆 试剂盒 构建 限制性内切酶酶切位点 限制性内切酶识别序列 克隆 大肠杆菌表达 构建重组质粒 限制性内切酶 多克隆位点 蓝白斑筛选 技术优势 目的基因 同源序列 载体构建 高通量 切割 大片 回收 | ||
1.一种基于无缝克隆技术的克隆载体制备方法，其特征在于：通过设计一对如图2所示的从引物5′至3′端依次为15-20bp同源臂序列、同一限制性内切酶识别位点和目的基因编码框扩增序列的引物扩增目的基因，其PCR产物经加A反应后，连接至pUM19-T出发载体中构建重组克隆载体；采用同一限制性内切酶单酶切重组克隆载体，回收载体片段，使用T4连接酶使其自连后构建前克隆载体；采用同一限制性内切酶单酶切前克隆载体，回收后载体片段即为本发明所述克隆载体。
2.根据权利要求1所述的一种基于无缝克隆技术的克隆载体制备方法，其特征在于：所述克隆载体的构建是以pUM19-T载体为出发载体，pUM19-T是在线性化pUC19载体的基础上，去除多克隆酶切位点。如果选定酶切前克隆载体的限制性内切酶在pUM19-T载体中存在识别位点，需先采用基因定点突变技术将该识别位点突变后，再构建前克隆载体。
3.一种基于无缝克隆技术的克隆载体，其特征在于：所述克隆载体两端的同源臂可以为任意大肠杆菌表达载体的多克隆位点中单一限制性内切酶酶切位点的上/下游15-20bp同源序列，因此，两端含有同源臂的PCR产物，可以同时通过同源重组置换到含有相同同源臂的克隆载体和表达载体中。
4.根据权利要求3所述的一种基于无缝克隆技术的克隆载体，其特征在于：所述克隆载体的使用是基于无缝克隆技术，无需限制性内切酶和连接酶，不受克隆载体和目的片段的限制性酶切位点限制，具有快速、定向克隆和重组效率高的技术优势。
5.一种基于无缝克隆技术的克隆载体试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括包装盒、衬垫、试剂管和使用说明书，其组成成分包括：一、线性化的pWMU19-T系列克隆载体；二、对照DNA片段(500bp)；三、无缝克隆酶；四、5×无缝克隆缓冲液；五、菌落PCR通用鉴定引物；六、无菌ddH2O。
6.根据权利要求5所述的一种基于无缝克隆技术的克隆载体试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中含有一对菌落PCR通用鉴定引物，其用于鉴定使用所述试剂盒构建的重组子，根据线性化pWMU19-T克隆载体序列设计的通用鉴定引物序列如下：pWMU19-T正向通用鉴定引物：5′-GCAACTGTTGGGAAGGG-3′pWMU19-T反向通用鉴定引物：5′-TGGAATTGTGAGCGGATA-3′。
7.一种基于无缝克隆技术的克隆载体试剂盒在分子生物学研究领域中的应用。
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