[发明专利]一种表达环状RNA的真核表达载体

说明书

本发明公开了一种表达环状RNA的真核表达载体。本发明普遍适用于各种circRNA的成环表达，表达效率高效、稳定；满足绝大多数circRNA的表达需求；应用该种载体表达circRNA操作简单易行，易于推广。本发明为研究circRNA的功能和机制提供了一个有力的研究工具，为进一步确定circRNA分子作为新型标志物及疾病治疗靶标的研究和开发提供理论支持。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于帮助环状RNA成环的真核表达载体。

背景技术

人类基因组计划及其后续的DNA元件百科全书计划(The Encyclopedia of DNAElements Project,ENCODE)研究成果表明，蛋白编码基因序列仅占人类基因组序列的1-3％，而人基因组中绝大部分可转录的序列为非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)。非编码RNA尽管不编码蛋白质，但由于广泛参与了细胞内基因表达调控，在生物医学研究领域一直备受关注。研究得较多的是线性的ncRNA分子，从RNA序列长短可分为微小RNA(microRNA,miRNA,19-23nt)和长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNAs,200nt)，它们在包括恶性肿瘤在内的多种人类常见疾病的发生发展中发挥着重要的功能。最近，一类全新的ncRNA分子，环状RNA(circular RNA,circRNA)由于其独特的构型和被日益发现的重要生物学功能，已经成为生物医学领域新的前沿和热点。

circRNA曾一度被当做基因转录后加工过程中的错误产物。和mRNA及lncRNA等线性RNA的加工过程很相似，circRNA的形成也是由剪接复合体对RNA前体进行剪接加工时生成的，只不过在这一过程中，侧翼的成环序列首先结合成环，随后剪接复合体进行剪接，最终将侧翼序列切除形成circRNA。近年来随着测序技术尤其是RNA-seq等新一代测序技术的发展，越来越多的circRNA被人们发现，并已经通过研究揭示了部分circRNA在众多的生命活动中都发挥着重要的作用。此外由于其独特的结构导致circRNA对核酸酶不敏感，在作为分子标志物的开发应用方面circRNA也具有明显优势，因此极有可能作为一种重要的分子标志物和新兴的药物开发的靶点。但由于本领域刚刚兴起，大部分circRNA尚未被发现或者尚无研究。

要研究circRNA的功能和调控机制一个必不可少的手段就是在细胞内过表达感兴趣的circRNA，观察其对细胞功能的影响。那么，要提高circRNA在细胞中的表达效率进而研究其功能和调控机制，需要高效、稳定的过表达基因研究的工具。

发明内容

本发明的目的是在于提供一种用于帮助环状RNA成环的真核表达载体。本发明普遍适用于各种circRNA的成环表达，表达效率高效、稳定；满足绝大多数circRNA的表达需求；应用该种载体表达circRNA操作简单易行，易于推广。为研究circRNA的功能和机制提供了一个有力的研究工具，为进一步确定circRNA分子作为新型标志物及疾病治疗靶标的研究和开发提供理论支持。

本发明通过以下技术方案来实现：

一种表达环状RNA的真核表达载体，它是由如下方法构建的：

(1)根据circRNA的形成机制和真核生物RNA剪接的基本法则，设计出适用于circRNA表达的上、下游成环序列；根据载体的序列信息，设计多克隆位点；

上游成环序列：

GTGCTGGGATTACAGGTGTGAGCTACCACCCCCGGCCCACTTTTT；如SEQ NO：1所示，

下游成环序列：

GAAAAGAATTAGGCTCGGCACGGTAGCTCACACCTGTAATCCCAGCA，如SEQ NO：2所示，