[发明专利]一种交联透明质酸细胞支架材料的制备方法

说明书

本发明涉及一种交联透明质酸细胞支架材料的制备方法。本发明中透明质酸细胞支架材料由透明质酸与二硫交联剂经过酰胺化反应，依次经过透析—冷冻干燥获得透明质酸细胞支架。该细胞支架具有丰富的孔隙，较好的机械强度在移植过程中不会破损，良好的生物相容性。该方法具有原料易得、反应条件温和、工艺简单等优点。制得的水凝胶交联网络中含二硫键，在还原性小分子谷胱甘肽存在下可快速裂解成单链。本发明制得的透明质酸支架力学性能、裂解性能、溶胀性能灵活可控，在促进软骨损伤修复、皮肤修复、细胞培养等方面具有应用前景。

技术领域

本发明属于生物材料领域，具体涉及一种还原响应性交联透明质酸细胞支架的制备方法。

背景技术

透明质酸是天然存在于人体皮肤中的具有保水功能的粘多糖，是细胞基质和玻璃体的重要组成部分。它是由(1‐β‐4)D‐葡萄糖醛酸(glucosamine)和(1‐β‐3)N‐乙酰基‐D‐葡萄糖(glucuronic)交替连接组成的一种线性聚阴离子粘多糖，以其独特的分子结构和理化性质在体内显示出重要的生理功能。目前透明质酸以其钠盐为主，广泛应用于化妆品、临床医学、食品等领域。其中，高纯度的透明质酸已广泛应用于眼科、骨科及术后防粘连。

透明质酸可显著促进主动脉及毛细血管内皮细胞的增殖和移动，保护肉芽组织免受氧自由基的破坏，能够促进伤口愈合。然而，透明质酸脆弱的机械性能以及在体内较快的降解速率限制了其应用前景。因此，交联、酯化、接枝等修饰方法常用于透明质酸的改性。目前常用的交联包括物理交联如硫酸钠、柠檬酸钠或三聚磷酸钠；化学交联如1,4‐丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)，1,2,7,8‐二环氧辛烷(DEO)，二乙烯基砜(DVS)等，通过调节交联剂的浓度及交联时间控制交联程度，延长透明质酸在体内的维持时间。以二乙烯基砜和1,4‐丁二醇二缩水甘油醚为交联剂的HA产品已广泛用于骨科关节炎治疗、手术防粘连、软组织修复和美容整形填充，但在组织工程领域还处于研究阶段。

透明质酸以其良好的生物相容性，利于种子细胞的黏附和增殖，常用作组织工程细胞支架。组织工程对支架材料的要求包括良好的生物相容性、适宜的生物降解性、三维多孔结构利于细胞的增殖、一定的机械强度。交联透明质酸支架用于负载细胞进行创面修复时，当种子细胞转移到待修复创面时，理想情况下需要载体材料自行降解。而实际情况中，由于交联后透明质酸的降解时间延长，若不能及时降解或移除，影响治疗效果。此外，载体的移除造成细胞的损失及创面的二次损伤。为解决这些问题，制备了环境响应性的细胞支架，在外界刺激下可实现靶向传送、触发释放且可控降解，在药物传送及组织修复中具有广阔的应用前景。

透明质酸的降解首选方法为生物大分子酶解法，专一性强、反应条件温和且无副产物，然而，透明质酸酶来源有限，且价格昂贵，在很大程度上限制了其应用。二硫键具有良好的刺激响应性能，在还原性条件下二硫键可有效断裂为巯基，因此，将二硫键引入交联透明质酸的结构中。CN101367884及CN103613686报道了通过半胱胺与透明质酸进行酰胺化反应，得到具有巯基的巯基‐透明质酸水凝胶，溶解，通过巯基之间的氧化反应形成二硫键。主要原理为巯基在空气中自氧化形成硫醇自由基，再相互碰撞交联形成稳定的二硫键，但是这一过程非常缓慢，形成二硫键的时间较长。为了加快巯基偶合的速率，CN105969825报道了以巯基透明质酸为原料，以辣根过氧化酶为催化剂，以酪胺盐酸盐为酶催化底物，通过反相乳液法结合辣根过氧化酶催化交联巯基形成含有二硫键的透明质酸凝胶。该方法中有机溶剂的残留及非离子表面活性剂的残留在材料的使用过程中造成一定的毒性。CN104910369报道了用醛基化透明质酸及侧链中含有二硫键的氨基/甲基丙烯酰双功能化透明质酸，光引发聚合得到交联透明质酸凝胶。二硫键在还原性小分子存在下可有效降解，降解得到的巯基透明质酸可被机体快速吸收，是培养体系具有良好的生物相容性。

目前报道的二硫化合物交联透明质酸，常用于在二硫苏糖醇(DTT)存在下制备巯基‐透明质酸，用于关节润滑及软骨修复。而用于皮肤修复的含有二硫键的交联透明质酸细胞支架的制备鲜有报道。

发明内容