[发明专利]一种提高染料脱色效率的漆酶突变体及其制备方法与应用

说明书

本发明公开了一种提高染料脱色效率的漆酶突变体及其制备方法与应用。通过定点突变将野生型漆酶的第428位赖氨酸突变为甲硫氨酸，将突变后的目的基因嵌入表达质粒pET‑30a（+）两酶切位点Nco I和Hind Ⅲ之间，转入E.coli BL21（DE3）获得表达菌株E.coli BL21（DE3）/pET30a‑K428M，经表达纯化得到漆酶突变体K428M。K428M与野生型漆酶具有相似的最适温度、最适pH和温度稳定性，但K428M显示比野生型漆酶更高的酶活、底物亲和力和催化效率。漆酶突变体K428M对活性艳蓝的脱色效率比野生型高15%左右；24h后K428M对RBBR的脱色效率达到了86%。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域和环境生物学领域，具体涉及一种提高染料脱色效率的漆酶突变体及其制备方法与应用。

背景技术

漆酶（benzenediol: oxygen oxidoreductases,EC1.10.3.2）是一种含有四个铜离子的氧化还原酶，属于多铜氧化酶（MCOs）家族。漆酶广泛的存在于自然界中，主要来源有植物、动物和微生物，其中微生物漆酶包括真菌漆酶和细菌漆酶。漆酶在自然界中有重要的作用，例如在昆虫中，它们参与甲壳的硬化；在植物中，参与细胞壁形成，还与木质素化和去木质素有关；在芽孢杆菌中，则是和抗紫外线的孢子组装有关；此外，漆酶还参与维持细菌中铜的稳态等等。由于漆酶催化反应的副产物只有水，所以它是公认的具有工业应用价值的绿色生物催化剂，其中，在染料脱色、有机合成、造纸工业、食品工业、生物传感器等方面有较大的应用潜力。

随着染料工业的发展,合成染料在纺织、皮革、食品、日用化工等行业中被广泛应用，因此，在这些工业生产过程中会排放大量含有染料的废水，这些废水含有复杂成分，这些成分稳定性高、难以降解，且多数染料及其代谢中间产物具有致畸、致癌和致突变性，对人体健康和生态环境都会造成极大的危害。利用微生物酶法进行染料废水的脱色更符合环保要求。漆酶作用底物十分广泛，能够催化氧化包括多酚类、二胺、芳胺类、羧酸类在内的多种有机物发生氧化、聚合等反应。因漆酶具有宽泛的作用底物，漆酶在废水的脱色、生物修复、有毒化合物降解等诸多领域有潜在的应用价值。

纺织废水中含有大量蒽醌类染料，蒽醌类染料是一类分子结构中含蒽醌基的染料, 包括还原蓝 RSN、中性艳蓝 GL、酸性蒽醌蓝、活性艳蓝X -BR、分散蓝 2BLN 等等。传统的蒽醌染料废水处理方法有物化法、化学法和生化法，其中, 生化法在处理蒽醌类染料废水方面具有明显的优势, 利用高效脱色微生物进行环境污染整治, 成本低, 且可以减少二次污染的产生, 因此被认为是染料脱色和降解最为绿色、经济、有效的方法。

发明内容

本发明的目的之一在于克服现有技术中的不足，提供一种提高染料脱色效率的漆酶突变体及其制备方法与应用。

本发明的目的通过以下技术方案实现。

一种提高染料脱色效率的漆酶突变体，该漆酶突变体是将来源于嗜热菌Thermus thermophilus SG0.5JP17-16的漆酶LacTT的第428位赖氨酸突变为甲硫氨酸，氨基酸序列如Seq3所示。

优选的，编码该漆酶突变体的核苷酸序列如Seq2所示。

以上所述的一种提高染料脱色效率的漆酶突变体的制备方法，包括以下步骤：

（1）通过引物K428M-1/K428M-2引入突变碱基，以Seq1所示的野生型漆酶的核苷酸序列为模板，分别扩增出含有突变碱基的上游片段和下游片段，并以含有突变碱基的上游片段和下游片段为模板，以TT-F/TT-R为引物，通过PCR获得完整的突变基因；