[发明专利]一种用于生物标记物筛选的抗体合成方法

权利要求书

1.一种用于生物标记物筛选的抗体合成方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、动物的选择与免疫，选择纯种BALB/C小鼠进行免疫；

S2、细胞融合：

A1、制备饲养细胞层：选取BALB/C小鼠，7-9周，处死，浸泡在75%酒精内，3-5min，剪开皮肤暴露腹膜，注入5-6ml预冷的培养液，反复冲洗吸出冲洗液，离心分离，用20%小牛血清的培养液混悬，加入96孔板；

A2、制备免疫脾细胞：取S1中加强免疫的小鼠处死，取脾研碎，用培养液洗2次，取脾淋巴细胞悬液备用；

A3、制备骨髓细胞：取对数生长骨髓瘤细胞离心，用无血清培养液洗2次，计数，取得细胞备用；

A4、融合；

S3、选择培养：使用HAT选择培养7-10天，之后使用HT培养液培养2周，之后采用一般培养液；

S4、杂交瘤克隆化；

S5、克隆抗体的大量生产：

B1、先腹腔注射0.5ml Pristane或液体石蜡于BALB/C鼠；

B2、1-2周后腹腔注射杂交瘤细胞；

B3、密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多，而小鼠频于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中。

2.根据权利要求1所述的一种用于生物标记物筛选的抗体合成方法，其特征在于，小鼠免疫具体步骤如下：

C1、初次免疫，抗原5-30μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射，一般0.5-1ml，0.25ml/点；

C2、二次免疫，3周后进行，剂量与初次相等，加福氏不完全佐剂皮下或ip，腹腔内注射；

C3、三次免疫，3周后进行，剂量与上次相等，不加佐剂、ip；

C4、加强免疫，2-3周后进行，剂量100-400μg为宜，ip或iv，静脉注射。

3.根据权利要求1所述的一种用于生物标记物筛选的抗体合成方法，其特征在于，A4中融合的具体步骤如下：

D1、将骨髓瘤细胞与脾细胞按1:10或1:5的比例混合在一起，在50ml离心管中用无血清不完全培养液洗1次，离心，1250rpm，5min；

D2、弃上清，用吸管吸净残留液体，90s内加入37.5℃预温的1ml 45%PEG溶液，边加边轻微摇动；

D3、37.5℃水浴作用90s；加37.5℃预温的不完全培养液以终止PEG作用，每隔2min分别加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml；

D4、离心，800rpm，6min；

D5、弃上清，用含20%小牛血清HAT选择培养液重悬；

D6、将上述细胞，加到已有饲养细胞层的96孔板内，每孔加100μl；

D7、将培养板置37.5℃、5%CO2培养箱中培养。