[发明专利]一种低表达BDNF转基因鼠模型及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种低表达BDNF转基因鼠模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、CMV-EmGFP-siRNA-BDNF低表达转基因片段的构建：沉默表达载体CMV-EmGFP-siRNA-BDNF购买自Invitrogen公司，并用该公司网站提供的软件针对目的基因BDNF(GeneID:12064)的靶位点，其中，靶位点为CCAAGTGTAATCCCATGGGTT，设计沉默的质粒，然后由中美泰和公司完成质粒构建；

步骤2、用构建好的沉默质粒转染293T细胞，然后用RT-PCR的方法筛选出沉默效果最好的；

步骤3、用AvrII将干扰效率最高的沉默质粒线形化，获得转基因片段，调整浓度至5ng/μL，用于显微注射；

步骤4、将构建好的转基因片段线性化，用显微注射法制作转基因小鼠；PCR鉴定阳性转基因鼠。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤4中的显微注射法制作转基因小鼠方法包含以下实验步骤：

a、超数促排卵操作，即第一天注射孕马血清促性腺激素10IU/只，48小时后注射人绒毛膜促性腺激素10IU/只；同时，选取健康雄性6周C57BL/6小鼠与上述接受促排卵操作的雌性小鼠1:1合笼交配，观察阴栓情况，有阴栓的小鼠提出待用，即为供卵小鼠，备用；

b、取卵：将供卵小鼠麻醉后腹部向上放置，备皮暴露腹部，用剪刀和镊子逐层分离皮肤、筋膜、肌肉，暴露卵巢、输卵管和子宫，分离输卵管，用镊子将输卵管放置到M2培养基中，解剖显微镜下打开输卵管的壶腹部，使卵流到培养液里；向培养液里加入1mg/ml的透明质酸酶，并用M2培养基冲洗3-4遍，去除颗粒细胞；在显微镜下进行观察，对受精卵与其他细胞进行鉴别，因受精卵排出第二极体，而未受精卵和其他变成异常形态的卵可以容易地进行区别；选好的受精卵，移到盛着M2培养基液滴的塑料皿中，移至二氧化碳孵箱中培养直到受精卵适合注射为止；

c.显微注射：显微注射法将线性化的转基因载体片段注射到C57BL/6小鼠的受精卵雄性原核中，在显微镜下观察，挑选细胞饱满，透明带清晰，雄原核清晰可见的受精卵待用；在载物玻片上作成有20个受精卵的培养液滴和转基因载体片段溶液滴，固定到载物台上，用持卵吸管将受精卵加以固定，玻璃吸管注入转基因载体片段溶液滴，将其缓慢地注入雄性原核，注射完毕后收集受精卵，37℃二氧化碳培养箱中培养一夜；

d.移植：将假孕小鼠麻醉，手术取出卵巢连接输卵管，用脂肪镊固定，在显微镜下找到输卵管开口，显微镜下，挑出分裂为两细胞的受精卵，备用；吸取上述受精卵，将移植管口插入输卵管口，轻轻将移植管内的液体吹入，看到输卵管壶腹部膨大并清晰地看到三个气泡，即移植成功；将卵巢连同输卵管放回腹腔，逐层缝合。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述的二氧化碳孵箱的温度为37℃，含有5％二氧化碳，95％空气。