[发明专利]一种用于双向测序的扩增子文库的构建方法

说明书

本发明属于高通量测序领域，本发明涉及一种用于双向测序的扩增子文库的构建方法、由该构建方法获得的扩增子文库、以及利用该扩增子文库进行双向测定的方法。本发明提供的文库构建方法使用的试剂更少，成本更低，速度更快。此外，使用本发明所述方法构建的文库中也存在着4种类型的文库，可以实现双向测序，得到高质量的测序数据。

技术领域

本发明属于高通量测序领域。具体而言，本发明涉及一种用于双向测序的扩增子文库的构建方法、由该构建方法获得的扩增子文库、以及利用该扩增子文库进行双向测定的方法。

背景技术

Ion torrent测序仪是赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)的一款商业测序仪，它的核心技术是使用半导体技术将测序过程中产生的化学信号直接转换为数字信号，从而实现碱基序列的准确测序。与其他测序仪相比，Ion torrent测序仪采用天然底物和聚合酶，无需荧光修饰的试剂、光学系统和照相系统，具有测序信号读取快、测序周期短、快速、灵活、可扩展等优势，已经成为主流的测序仪之一，广泛应用于农学、法医、医学和科研等众多领域。

目前，应用于Ion torrent测序仪的主流文库构建方法是Life Technology公司开发的扩增子文库构建技术，其文库构建流程如图1所示：第1步：采用多重PCR技术对多个目标区域进行扩增，得到扩增子产物；第2步：对扩增子产物进行酶消化，特异性去除扩增子产物两侧的部分引物序列；第3步：采用DNA连接酶，将测序接头序列A和P1连接到扩增子产物的两侧，得到扩增子文库；第4步：采用磁珠试剂对扩增子文库进行纯化。在第3步，由于测序接头A和P1随机连接到扩增子产物的两侧，因此从理论上讲，构建好的文库存在4种类型：第1种，两侧均为A接头；第2种，两侧均为P1接头；第3种，左侧为A接头，右侧为P1接头；第4种，左侧为P1接头，右侧为A接头。其中，第1种文库和第2种文库在后续乳液PCR扩增及测序过程中，会被过滤，因此为无效的文库。与Illumina测序仪不同，Ion torrent测序仪只能从A接头测序。因此，如果文库中同时存在第3种文库和第4种文库，便可以实现双向测序，得到该文库的正反链序列信息，然后通过内置的程序对正反链碱基序列进行校正，提高测序数据的准确性。如果文库中只存在第3种文库或者第4种文库，便只能进行单向测序，得到正链或者反链的序列信息，由于无法进行正反链序列的校正，因此测序数据往往偏好性较强，测序数据准确度较低，往往无法满足后续数据的深度分析。因此，在Ion torrent测序平台上构建得到的文库，需要同时具有第3种和第4种结构，才能实现双向测序，得到高质量的测序数据，满足后续的数据分析要求。

尽管Life Technology公司已经开发出针对Ion torrent测序平台的扩增子文库构建方法，但是该方法在酶消化和测序接头连接过程中还存在诸多缺陷，例如使用较多的反应试剂，需要对扩增子产物进行消化切割以及采用酶连接处理，成本较高，且速度较慢。另外，除了Life Technology公司已经开发出的扩增子文库构建方法而外，本领域也亟需一种可替代的扩增子文库构建方法，由此可以为本领域技术人员提供更多的选择。

综上，本领域亟需一种可替代的扩增子文库的构建方法，该方法不仅简便、快捷，而且成本低廉。

发明内容

为解决背景技术部分所述及的技术问题，本发明人经过反复的研究，开发出了另外的可替代Life Technology公司开发出的扩增子文库构建方法的方法，由此完成本发明。具体地，本发明提供了一种用于双向测序的扩增子文库的构建方法，其主要流程如下：采用多重PCR技术对多个目标区域进行扩增，得到扩增子产物；采用磁珠纯化扩增子产物；采用接头PCR反应，将上下游测序接头序列引入到扩增子的两侧，得到扩增子文库；采用磁珠纯化扩增子文库。

因此，在第一方面，本发明涉及一种扩增子文库的构建方法，所述扩增子文库用于双向测序，且所述构建方法包括以下步骤：