[发明专利]一种耐高浓度木质纤维素预处理副产物的β-葡萄糖苷酶高通量筛选方法

说明书

本发明涉及高通量筛选领域，提供了一种耐高浓度木质纤维素预处理副产物的β‑葡萄糖苷酶高通量筛选方法。该方法的主要步骤：将β‑葡萄糖苷酶于含有七叶苷和枸橼酸铁铵的平板培养基上进行分泌表达，挑取阳性克隆子于普通平板培养基上生长，再将七叶苷、枸橼酸铁铵和木质纤维素预处理副产物(糠醛、5‑羟甲基糠醛、甲酸、乙酸、乙酰丙酸、木质素衍生物、盐等)加入到普通平板培养基上，于一定温度下反应1‑2h，获得能产生黑色光圈的突变酶。该方法可应用于基于定向进化的耐高浓度木质纤维素预处理副产物β‑葡萄糖苷酶的高通量筛选，使耐高浓度木质纤维素预处理副产物的β‑葡萄糖苷酶更适合于二代生物能源生产、食品工业、制药等领域。

技术领域

本发明属于β-葡萄糖苷酶的木质纤维素预处理副产物耐性筛选领域，涉及基于显色化合物平板培养基筛选的耐木质纤维素预处理副产物的高通量筛选方法。

背景技术

β-葡萄糖苷酶是木质纤维素糖化最关键的限速酶，广泛用于二代生物能源生产、食品工业、制药等领域。

纤维素的降解主要涉及到三种纤维素酶，分别是纤维素外切酶、纤维素内切酶和β-葡萄糖苷酶，纤维素外切酶主要作用于微晶纤维素的还原端或非原端生成纤维二糖，而纤维素内切酶主要作用于不定形纤维素的内部产生纤维二糖和纤维寡糖，β-葡萄糖苷酶主要作用于纤维二糖和纤维寡糖生成葡萄糖。为了实现二代生物燃料的工业化生产，节约生产成本以及提高反应器容积效率是首要任务，因此，增加预处理纤维素浓度是一种很好的解决方案。但是，在木质纤维素预处理过程中，会产生糠醛、5-羟甲基糠醛、甲酸、乙酸、乙酰丙酸、木质素衍生物、盐等主要副产物，在后续的糖化过程中，β-葡萄糖苷酶会受到高浓度木质纤维素预处理副产物的抑制而失去活性，造成大量纤维二糖积累。因为竞争性抑制和非竞争性抑制的影响，同时导致纤维素外切酶和纤维素内切酶活性的完全丧失，纤维素停止了酶解反应。很多研究团队已采用定向进化技术改造β-葡萄糖苷酶，但是主要用于获得高活性、高稳定性的β-葡萄糖苷酶的筛选，因此，为了解决β-葡萄糖苷酶受高浓度木质纤维素预处理副产物抑制的问题，采用定向进化技术是一种不错的选择，然而目前尚未发现类似报道，其中很可能最主要原因是没有找到一个合适的高通量筛选方法。

发明内容

基于以上所存在的问题，本发明提供了一种基于平板筛选技术用于获得耐高浓度木质纤维素预处理副产物的β-葡萄糖苷酶高通量筛选方法。

本发明采用以下技术方案：

一种耐高浓度木质纤维素预处理副产物的β-葡萄糖苷酶高通量筛选方法，其特征在于，采用显色化合物平板培养基进行高通量筛选，其主要步骤：

(1)将β-葡萄糖苷酶于含有七叶苷和枸橼酸铁铵的平板培养基上进行分泌表达；

(2)挑取阳性克隆子于普通平板培养基上生长；

(3)再将2-12mL的七叶苷、枸橼酸铁铵和一定浓度木质纤维素预处理副产物的溶液加入到长有阳性克隆子的普通平板培养基上，于一定温度下反应1-2h，获得能产生黑色光圈的突变酶。

上述的“含有七叶苷和枸橼酸铁铵的平板培养基”中，七叶苷浓度为0.05-0.25％，枸橼酸铁铵浓度为0.2-3％。

在木质纤维素预处理过程中会产生大量副产物，主要副产物为糠醛、5-羟甲基糠醛、甲酸、乙酸、乙酰丙酸、木质素衍生物、盐等成分。上述的“七叶苷、枸橼酸铁铵和一定浓度葡萄糖的溶液”中，七叶苷浓度为0.05-0.25％；枸橼酸铁铵浓度为1-2％；木质纤维素预处理各种副产物，糠醛(5-50mg/mL)、5-羟甲基糠醛(0-80mg/mL)、甲酸(0-25mg/mL)、乙酸(0-50mg/mL)、乙酰丙酸(20-60mg/mL)、木质素衍生物(5-30mg/mL)、盐(甲酸、乙酸和乙酰丙酸的盐，0-60mg/mL)等，浓度为0-80mg/mL。