[发明专利]环状RNA和microRNA在结直肠癌筛查诊断的应用

说明书

本发明提供对生物样品中的直肠结肠癌细胞进行筛查诊断的检测方法，所述的方法包括检测肿瘤组织或粪便样品中RNA序列的检验步骤，所述RNA包括环状RNA(hsa_circ_0006859、hsa_circ_0051240a、hsa_circ_0000722、hsa_circ_0000267和hsa_circ_0001190)和microRNA(miR‑21和miR‑135b)。circRNA和microRNA结构稳定且能反映细胞基因表达信息，为结直肠癌筛查诊断以及预后监测提供方便、快捷、准确的检测手段。

技术领域

本发明属于细胞核糖核酸(RNA)的应用，具体涉及多种环状RNA(circRNA)和microRNA，及其相关的基因表达检测方法和试剂盒，用于对结直肠组织以及肠道排泄物进行分析，以作为结直肠癌筛查诊断的特异生物学标志分子。

背景技术

结直肠癌(Colorectal cancer，CRC，也称为结肠直肠癌或大肠癌)是癌症相关死亡的主要原因之一。CRC患者如果能够在疾病发生早期得到及时诊断和治疗，将会显著改善CRC生存率。由于大部分CRC患者早期阶段无症状表现，因而开发一种能够及早对CRC进行检测诊断的肿瘤筛查方法对于降低CRC发病率和死亡率至关重要(Force USPST等JAMA.2016；315：2564-2575)。虽然目前推荐结肠镜检查作为CRC的筛查方法，但由于其应用不便，尚未被人们广泛接受。另外，粪便潜血试验(FOBT)的灵敏度较低，需要细致的饮食限制。因此，从患者样品中检测CRC相关的生物标志物(Biomarker)是一种方便有效的肿瘤筛查和诊断方法。然而，缺乏稳定的生物标志物是目前癌症早期筛查的主要挑战之一，理想的CRC筛查和诊断的生物标志物尚未完全确定。因此，面对CRC早期检测灵敏度严重不足、CRC相关生物标志物缺乏稳定性的现状，急需开发出一种能够用于CRC早期检测的、具有高度灵敏度的、并且能够被稳定检测的理想生物标志物，从而为及早对CRC进行检测诊断提供手段。

目前研究发现CRC的病因较为复杂，除了遗传因素，还涉及年龄、环境和饮食等。多种基因或表观遗传改变引起致癌基因激活和肿瘤抑制基因失活，导致结肠上皮细胞周期异常，出现无限增生。这些细胞遗传学改变反映了肿瘤发展的生物学过程，被认为是潜在的肿瘤细胞分子标记，能为临床医师提供诊断、预后和预测治疗反应信息。按照分子生物学中心法则，大量研究工作针对肿瘤细胞来源的DNA、RNA或蛋白质信息进行开发，以期获得新颖的生物标志物检测方法。与传统检测方法相比，分子生物学检测技术是一种灵敏度、准确度、特异性极高的检测方式。基因转录产生的RNA携带了细胞遗传信息，除了进一步编码成蛋白质，还能够直接与某些分子相互作用，已证明其参与了与肿瘤细胞增殖、凋亡和迁移相关的关键信号传导途径。在人转录组中，能翻译成蛋白质的mRNA比例很小，大部分为非编码RNA，例如长非编码RNA、核糖体RNA和microRNA等等。非编码RNA的检测可发展作为CRC发病机制相关的表观遗传标记，它们的表达模式揭示细胞行为和状态，是肿瘤细胞生物学研究的重要信息。

随着RNA测序技术和生物信息学的发展，一种非编码RNA——环状RNA(circRNA)的发现已成为一个新研究热点。circRNA的生物学特性使其成为一类重要的临床诊断指标(Barrett SP等，Development.2016；143：1838-1847)。circRNA是一种非线型的环状核糖核酸。多种肿瘤组织表达不同丰度的circRNA。circRNA同时具有细胞类型特异性和生物学保守性。区别于其他RNA分子，circRNA的5’和3’首末端形成共价连接，并不被普通RNA酶降解，因此具有非常稳定的半衰期(＞48小时)。本研究通过对CRC标本进行高通量RNA测序分析，新发现数个与CRC相关的circRNA(SEQ-ID.1至5)。肿瘤相关基因转录环化拼接(Backsplicing)产生的circRNA可作为CRC的发生和发展的标志物。我们首次发现这些circRNA在CRC组织表达升高，然而circRNA的产生机制与肿瘤细胞的基因突变的联系需进一步研究。circRNA与其宿主基因表达水平不一定成正相关，但其联合检测可以为肿瘤细胞的发现提供更多实验证据。