[发明专利]一种狂犬病毒颗粒的纯化方法

说明书

本发明公开了一种狂犬病毒颗粒的纯化方法，包括将病毒液进行次序可互换的阴离子交换层析和羟基磷灰石层析。本发明方法的有益效果在于：狂犬病毒液的前处理工艺要求低，不会对狂犬病毒颗粒造成二次破坏，可以在不调整工艺条件的情况下，处理各种培养基质培养得到的病毒液，处理量大，处理成本低；提高了狂犬病毒颗粒的结构均一性，通过离子交换层析和羟基磷灰石层析，可将目标病毒颗粒与分子量接近但结构异常的病毒颗粒有效分离。

技术领域

本发明属于病毒生物学技术领域，具体涉及一种狂犬病毒颗粒的纯化方法。

背景技术

狂犬病毒是一种包膜病毒，结构复杂且变化较大，因此，获得纯度高、结构均质的狂犬病毒颗粒非常困难。

狂犬病毒颗粒由一条单链RNA分子(约11930个核苷酸)和5种蛋白质构成，其中，20～150个L蛋白、950个P蛋白和单链RNA组成结构稳定的核衣壳，核衣壳外包裹来源于宿主细胞的双层脂质膜，核衣壳与脂质膜之间添充了1650个M蛋白；脂质膜表面插入了不同数量的G蛋白，G蛋白上连接了不同数量和不同长度的糖链。G蛋白的数量和糖基化程度对病毒颗粒的生物学特性和免疫学特性具有重大影响。

目前狂犬病毒培养所用培养基质包括小鼠脑、鸡胚、鸭胚、地鼠肾原代细胞、鸡胚原代成纤维细胞病毒、人二倍体细胞和Vero细胞等，无论使用何种培养基质，狂犬病毒收获液都是一个成分复杂的混合物体系。其包括各种结构的狂犬病毒颗粒及各种杂质。

完整的狂犬病毒颗粒大小约75×180nm，分子量5～8×10⁸，沉降系数600S，在蔗糖溶液中的浮力密度1.14～1.17g/ml。脱落细胞直经约5μm，大部分细胞碎片直经在0.8μm以上，均明显大于病毒颗粒；大部分宿主细胞蛋白质、糖类、脂类和RNA(主要是tRNA和rRNA)分子量在1000KD以下，均明显小于病毒颗粒(mRNA分子量较大，但极不稳定，在收获液中含量微少)；宿主细胞DNA则包含了大于、小于和相当于病毒颗粒大小的系列组分；产品相关杂质也是大小不均的系列组分，包括大于(病毒聚团)、小于(病毒裂解、破碎、未装配成病毒颗粒的亚单位大分子)及相当于有效成分大小(病毒颗粒大小接近但G蛋白拷贝数低、糖基化异常，免疫原性低，故一般列为杂质)的各种成分。

目前，狂犬病毒的分离原理主要是利用分子量大小差异将病毒颗粒和杂质分离。分离技术路线主要包括：密度梯度超速离心纯化技术和凝胶过滤柱层析纯化技术。由于病毒收获液中部分大分子杂质的分子筛性质与有效成分非常接近，单纯依靠分子筛原理很难进行有效分离。这类杂质包括：

(1)来源于宿主细胞的高分子量蛋白质。培养过程中宿主细胞表达的蛋白质数量在2万种以上，分子量大小不均，许多蛋白质以多聚体形式存在。因此，病毒收获液中的宿主细胞蛋白质(HCP)是一个组成复杂的混合物，其中包括分子筛性质与病毒粒子接近的组分。

(2)来源于宿主细胞的DNA。病毒收获液中游离的DNA是通过宿主细胞的破碎、病变、坏死或凋亡产生的，这些细胞生物学过程都会产生基因组DNA被剪切成大小不同片段的结果。因此，病毒收获液中的宿主细胞DNA也是一个分子量大小高度不均一的混合物。一些工艺步骤如超滤浓缩产生的剪切效应还会进一步增加DNA分子量大小的不均一性。一部分DNA组分的分子筛性质与病毒粒子非常相近。

(3)来源于培养基添加物如牛血清，牛血清也是一种成分复杂的混合物。

(4)来源于狂犬病毒的结构衍生物。病毒培养过程中，通常会产生一部分结构不完整的病毒粒子，如G蛋白拷贝数过低、糖基化缺失或不完全的病毒。这些结构不完整的病毒粒子与结构完整的病毒粒子在生物学性质和免疫学性质等方面有显著差别，但其分子筛性质与结构正常的病毒粒子十分接近，不易分离。

基于以上原因，现有的狂犬病毒颗粒纯化方法很难将狂犬病毒颗粒和其他杂质有效分离，更难做到将结构不同或异常的狂犬病毒颗粒分离。