[发明专利]一种利用构建含有△12-脂肪酸脱氢酶基因的表达载体筛选转基因花生的方法

说明书

本发明涉及一种利用构建含有△12‑脂肪酸脱氢酶基因的表达载体筛选转基因花生的方法，属于基因工程领域。本发明以低油酸花生的△12‑脂肪酸脱氢酶基因AhFAD2B为标记基因，构建了一种含有△12‑脂肪酸脱氢酶基因的植物表达载体，实现了花生内源基因在遗传转化后代的快速筛选中的应用，该方法通过花生种子单粒近红外检测，可以在不损伤种子的条件下，快速、高效的筛选出转化体。本发明避免了利用抗生素筛选存在的假阳性、步骤繁琐和安全隐患等问题，而且转化效率高，操作简单，是一种安全、高效的筛选方法。

技术领域

本发明涉及一种利用构建含有△12-脂肪酸脱氢酶基因的表达载体筛选转基因花生的方法，属于基因工程领域。

背景技术

花生是重要的油料作物，油酸和亚油酸是其油脂中的主要成分。研究发现，花生高油酸特性由2个主效基因控制，Jung等从普通花生及高油酸花生突变体(以SunOleic95R为父本杂交获得)中分离了这两个基因：AhFAD2A和AhFAD2B(Jung S,Swift D,Sengoku E,Patel M,Teule F,Powell G,Moore K,Abbott A.The high oleate trait in thecultivated peanut Arachis hypogaea L.I.Isolation and characterization of twogenes encoding microsomal oleoyl-PC desaturases.Mol Gen Genet,2000,263:796-805.)。这两个基因均编码△12-脂肪酸脱氢酶，主要作用是催化油酸在碳12位去饱和产生亚油酸，是控制油酸和亚油酸含量的关键酶。在高油酸花生突变体F435中AhFAD2B 442bp处有一单核苷酸“A”插入，其插入导致移码突变，从而产生无活性蛋白质；在AhFAD2A 448bp处有单个核苷酸G到A的替换，结果是AhFAD2A编码的△12-脱氢酶活性降低。AhFAD2A和AhFAD2B同时突变可以产生高油酸表型，即油酸含量在70％以上，而单个基因的表达导致油酸含量降低到70％以下。

在花生遗传转化过程中，利用抗生素类基因和抗除草剂类基因作为筛选标记基因进行筛选时，可能会对环境及人类健康产生不良影响和损害。因此，利用无争议的生物安全标记基因来构建表达载体，便逐渐成为新的研究热点。中国专利文献CN102433354A(申请号201110361128.7)公开了一种将木糖异构酶基因用于花生遗传转化的筛选方法，该方法从大肠杆菌中扩增获得木糖异构酶基因，构建重组表达载体，在以木糖为主要碳源的培养基上，转化体因能利用木糖而呈现优势生长，非转化体则因碳源供应不足而使生长受到抑制不能成苗。该方法是使用异源基因表达异源蛋白作为筛选标记。

AhFAD2B基因为花生内源基因，其蛋白产物为△12-脂肪酸脱氢酶，催化油酸转化成亚油酸。亚油酸是一种ω-6必需脂肪酸，有抗血栓，保肝等功能。以高油酸花生为转化受体，将AhFAD2B基因作为筛选标记基因进行转化，转化后代可通过单粒近红外检测油酸含量的方法确定转化阳性株系。该方法不损伤种子，不影响样本的后续使用，操作非常简单，方便。因此，用AhFAD2B基因作为筛选标记基因是行之有效的方法。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种利用构建含有△12-脂肪酸脱氢酶基因的表达载体筛选转基因花生的方法。本发明构建了含有AhFAD2B基因的植物表达载体pCAMBIA2300-AhFAD2B，并通过农杆菌介导的花萼管注射法转化花生，转基因阳性率达到13.5％。本发明避免了利用抗生素筛选存在的假阳性、步骤繁琐和安全隐患等问题，而且转化效率高，操作简单，是一种安全、高效的筛选方法。

本发明的技术方案如下：

△12-脂肪酸脱氢酶基因AhFAD2B作为标签在筛选转基因花生中的应用，所述△12-脂肪酸脱氢酶基因AhFAD2B的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种利用构建含有△12-脂肪酸脱氢酶基因的表达载体筛选转基因花生的方法，包括以下步骤：