[发明专利]一种用丝状真菌宿主细胞表达的重组草酸脱羧酶

权利要求书

1.一种重组表达草酸脱羧酶的方法，其特征在于：

重组草酸脱羧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1-8所示，通过重组丝状真菌里氏木霉宿主细胞表达，致使重组草酸脱羧酶的糖基化修饰形式和程度不同于原始宿主细胞表达的草酸脱羧酶，所述重组草酸脱羧酶具有里氏木霉表达系统特有的糖基化修饰形式和程度。

2.权利要求1所述的重组表达草酸脱羧酶的方法，其特征在于：

所述重组丝状真菌里氏木霉宿主细胞包含一个或多个拷贝的整合在其基因组中的草酸脱羧酶表达盒，所述草酸脱羧酶表达盒包括启动子、信号肽编码序列、草酸脱羧酶编码基因和终止子，所述方法包括如下步骤：

S1：构建至少一个整合型表达载体，所述整合型表达载体包括选择标记基因表达盒和草酸脱羧酶表达盒，

S2：整合型表达载体在转化丝状真菌里氏木霉宿主细胞后，通过筛选获得含有一个拷贝或多个拷贝草酸脱羧酶表达盒的重组丝状真菌宿主细胞。

3.根据权利要求1所述的重组表达草酸脱羧酶的方法，其特征在于，所述丝状真菌里氏木霉宿主细胞表达的重组草酸脱羧酶在pH值1.5-7.0的条件下保持其全部或部分酶活力，且在pH值1.5-2.5的条件下保持不低于其在最适pH条件下酶活力的10%，在pH值2.5-4.5的条件下保持不低于其在最适pH条件下酶活力的50%，在pH值4.5-7.0的条件下保持不低于其在最适pH条件下酶活力的25%。

4.根据权利要求1所述的重组表达草酸脱羧酶的方法，其特征在于，所述丝状真菌里氏木霉宿主细胞表达的重组草酸脱羧酶的最适pH值为2.5-3.5。

5.根据权利要求1-4任一所述的重组表达草酸脱羧酶的方法，其特征在于，所述草酸脱羧酶编码基因的核苷酸序列中至少10%的碱基根据丝状真菌宿主细胞密码子偏爱性进行了密码子优化。

6.根据权利要求5所述的重组表达草酸脱羧酶的方法，其特征在于，所述草酸脱羧酶的编码基因核苷酸序列选自SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16的核酸序列。

7.根据权利要求2所述的重组表达草酸脱羧酶的方法，其特征在于，步骤S2中所述的丝状真菌里氏木霉宿主细胞为人工构建的营养缺陷型细胞，所述整合型表达载体在整合进所述丝状真菌里氏木霉宿主细胞基因组中时能修复该类型营养缺陷。

8.根据权利要求2所述的重组表达草酸脱羧酶的方法，其特征在于，在转化丝状真菌里氏木霉宿主细胞后，所述整合型表达载体通过非同源重组而随机整合进丝状真菌里氏木霉宿主细胞基因组中。

9.根据权利要求2所述的重组表达草酸脱羧酶的方法，其特征在于，所述的整合型表达载体包含与丝状真菌里氏木霉宿主细胞基因组中特异性基因座一定长度核苷酸序列同源的5’端同源臂和3’端同源臂，从而在转化丝状真菌里氏木霉宿主细胞后所述整合型表达载体能通过同源重组的方式整合进基因组特定的位点。

10.根据权利要求9所述的重组表达草酸脱羧酶的方法，其特征在于，所述基因组特定的位点为编码胞外蛋白的基因。

11.根据权利要求10所述的重组表达草酸脱羧酶的方法，其特征在于，所述基因组特定的位点为编码胞外蛋白酶类或编码胞外糖苷水解酶类的基因。

12.根据权利要求11所述的重组表达草酸脱羧酶的方法，其特征在于，所述胞外蛋白酶类或编码胞外糖苷水解酶类的基因为CBH1、CBH2、EG1或EG2基因。