[发明专利]一种小分子可溶性肽聚糖的制备方法

说明书

本发明公开了一种小分子可溶性肽聚糖的制备方法，包括下述步骤：首先将活化好的细菌菌种配制成菌悬液接入液体培养基中，37℃培养至生长衰败期，再继续培养1~2天；得到的培养基置于沸水中灭活后，离心10分钟后取上清，用三氯乙酸滴至无沉淀，静置8小时，离心取上清；最后将上清液置于8kd透析袋中，蒸馏水透析，然后将透析袋内的剩余液体用95%乙醇沉淀，分离、干燥后得到可溶性肽聚糖。经测定，本发明制备的可溶性肽聚糖的分子量呈弥散性，范围为36KD‑150KD。本发明利用细菌的过渡生长产生自溶现象制备肽聚糖，降低了菌体破碎的要求，工艺流程简单，生产成本也大大降低；得到的肽聚糖溶解度和免疫活性高，为肽聚糖应用于医学检验等方面提供了可能性。

技术领域

本发明涉及肽聚糖的制备，尤其是涉及一种小分子可溶性肽聚糖的制备方法。

背景技术

肽聚糖（Peptidoglycan,PG）是细菌细胞壁的特有组成部分，其基本结构是由N-乙酰葡萄糖胺（N-Acetylglucosamine）和N-乙酰胞壁酸（N-Acetylmuramic Acid）通过β-1,4糖苷键连接而成的双糖单位，同时糖链间由肽链交联，构成稳定的网状结构。不同细菌来源肽聚糖的肽链构成有所不同。革兰氏阳性细菌细胞壁所含的肽聚糖占干重的50%-80%，革兰氏阴性菌细胞壁所含的肽聚糖占干重的5%-20%，肽聚糖在机体免疫力提高以及食品药品的无菌性检测方面有着重要作用，近年来肽聚糖与临床血流细菌感染的相关性也逐渐受到重视。目前细菌肽聚糖的制备方法主要是通过对细菌液体培养物进行离心或是直接挑取细菌固体培养基单菌落获得菌体，然后用物理或化学方法对收集到的菌体进行处理，破坏细菌的细胞壁，再通过提纯获得肽聚糖，此方法获得的肽聚糖交联度高，几乎不溶或微溶于水，无法直接进行分子量测定，同时活性位点暴露不完全，免疫活性不强，严重限制了肽聚糖在各个领域的研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种小分子可溶性肽聚糖的制备方法，使用该方法制备的可溶性肽聚糖较常规方法制备的肽聚糖的溶解性和免疫活性均有极大提高。

为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：

本发明所述的小分子可溶性肽聚糖的制备方法，包括下述步骤：

第一步，将活化好的细菌菌种配制成0.5麦氏菌悬液，按照1%~5%的接种量接入液体培养基中，37℃培养至生长衰败期，再继续培养1~2天；

第二步，将第一步得到的培养基置于沸水中20分钟灭活，然后离心10分钟后取上清，用三氯乙酸滴至无沉淀后，静置8小时，离心取上清；

第三步，将第二步得到的上清液置于截留分子量为8kd透析袋中，以蒸馏水为透析液透析三天，然后将透析袋内的剩余液体用95%乙醇沉淀，分离、干燥后得到可溶性肽聚糖。经测定，本发明制备的可溶性肽聚糖的分子量呈弥散性，范围为36KD-150KD。

为提高可溶性肽聚糖的产量，在进行第二步灭活前可以采用物理方法（如超声波处理）或化学方法（如溶菌酶处理）促进第一步中的菌体溶解，然后对菌体溶解物再进行第三步处理。

本发明的优点在于利用细菌的过渡生长产生自溶现象制备肽聚糖，降低了菌体破碎的要求，工艺流程简单，生产成本也大大降低。通过对处于生长衰败期细菌的液体培养基进行处理，离心取上清，然后从上清中提取可溶性肽聚糖。通过本方法制备的肽聚糖在水中的溶解度是常规方法制备所得肽聚糖溶解度的500倍以上，配制的同浓度肽聚糖水溶液免疫反应活性是常规方法制备肽聚糖的1000倍左右，为肽聚糖应用于医学检验等方面提供了可能性。

具体实施方式

一、本发明所述的本发明所述的小分子可溶性肽聚糖的制备方法，包括下述步骤：

第一步，细菌培养

将活化好的细菌菌种配制成0.5麦氏菌悬液，按照1%~5%的接种量接入液体培养基中，37℃培养至生长衰败期，再继续培养1~2天；