[发明专利]一种检测核酸外切酶I活性的探针及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种检测核酸外切酶I活性的探针及其制备方法和应用。所述探针是由单链DNA为模板制备的DNA/Au纳米簇，即ssDNA‑AuNCs；所述单链DNA由4‑30个重复的AC碱基序列构成。所述ssDNA‑AuNCs探针由水合氯金酸和单链DNA及抗坏血酸反应合成，以金纳米簇为荧光物质，制备方法简单，易操作，制得的探针荧光反应明显，本发明利用核酸外切酶I剪切单链DNA分子的特性，以及复合在单链DNA分子上的Au纳米簇在失去DNA分子保护后会聚集在一起失去荧光的特性，通过核酸外切酶I与所述探针反应后体系的荧光变化，判断核酸外切酶I的活性，检测方式简单，可靠性高。

技术领域

本发明涉及酶活性的检测技术领域，具体涉及一种检测核酸外切酶I活性的探针及其制备方法和应用。

背景技术

核酸外切酶I(Exonuclease I,ExoI)是单链特异性3’→5’核酸外切酶，从ssDNA的3’-OH末端分解生成5’-单核苷酸。对单链DNA的特异性非常高，不分解双链DNA及RNA。核酸外切酶I对单链DNA的高度特异性，使其成为分子生物学领域中一种非常重要的工具酶，应用非常广泛。金纳米簇(AuNCs)是一种新型的荧光纳米材料，其具有尺寸小、无毒、水溶性好、光稳定性好、比表面积大、制备条件温和、表面易于修饰以及荧光性质随尺寸可调等突出优点，是近年来的研究热点。

荧光检测法在研究中不会破坏样品、灵敏度高，适应用来做生物技术领域的检测。近年来，有利用荧光法检测核酸外切酶活性的方法，而这些方法都存在一些缺点，如反应时间过长，需要对核酸探针进行荧光基团以及猝灭基团的双标记或者需要外加猝灭材料，灵敏度低、选择性差，需要严格精密地设计DNA的碱基序列，方能达到较好的猝灭效果，荧光染料分子标记的DNA探针非常昂贵等问题，大大地增加了实验体系的复杂性以及成本，从而限制了检测方法的应用。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种检测核酸外切酶I活性的探针及其制备方法和应用，所述ssDNA-AuNCs探针以AC碱基序列重复的单链DNA为模板，以合成的金纳米簇为荧光物质，不需要提前对DNA链进行修饰，合成金纳米簇的过程简单，探针荧光反应明显，且成本低、易操作、普及性强；本发明利用核酸外切酶I剪切单链DNA分子的特性，以及复合在单链DNA分子上的Au纳米簇在失去DNA分子保护后会聚集成较大粒子失去荧光的特性，通过核酸外切酶I与所述探针反应后体系的荧光变化，判断核酸外切酶I的活性，检测方式简单，可靠性高。

本发明的技术方案为：一种检测核酸外切酶I活性的探针，其特征在于：所述探针是由单链DNA为模板制备的DNA/Au纳米簇，即ssDNA-AuNCs探针；所述单链DNA由4-30个重复的AC碱基序列构成。

一种检测核酸外切酶I活性的探针的制备方法，其特征在于，通过以下方法制得：

1)将单链DNA溶于磷酸缓冲液中得到8-12μM DNA溶液；

2)将水合氯金酸加入到步骤1)所述DNA溶液中得到混合溶液，所述混合溶液中水合氯金酸与所述单链DNA的摩尔比为16-20:1，搅拌3-10分钟；

3)再在所述混合溶液中加入抗坏血酸，所述抗坏血酸与所述单链DNA的摩尔比为20-40:1，然后在70-90℃搅拌1-6小时后合成得到DNA/Au纳米簇，即ssDNA-AuNCs探针；

所述单链DNA由4-30个重复的AC碱基序列构成。

一种检测核酸外切酶I活性的探针的制备方法，其特征在于，通过以下方法制得：

1)将单链DNA溶于磷酸缓冲液中得到10μM DNA溶液；

2)将水合氯金酸加入到步骤1)所述DNA溶液中得到混合溶液，所述混合溶液中水合氯金酸与所述单链DNA的摩尔比为18:1，搅拌5分钟；