[发明专利]用于检测多种病原体的试剂盒及其使用方法

权利要求书

1.一种用于检测肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括含有检测试剂的检测管、阳性质控品和和无RNase水组成；其中，检测试剂单管分装，为干粉形态，包括有肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌的特异性保守序列的引物及Taqman荧光探针；

所述特异性保守序列的引物序列为：

肺炎支原体，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；

肺炎衣原体，SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5；

嗜肺军团菌，SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；

所述特异性保守序列的Taqman探针序列为：

肺炎支原体，SEQ ID NO.3；

肺炎衣原体，SEQ ID NO.6；

嗜肺军团菌，SEQ ID NO.9。

2.根据权利要求1所述的用于检测肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌的试剂盒，其特征在于，所述检测试剂还包括有PCR缓冲液、海藻糖、牛血清白蛋白、dATP、dUTP、dCTP、dGTP、MgCl₂、HotStart Taq酶和UNG酶。

3.根据权利要求1所述的用于检测肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌的试剂盒，其特征在于，所述引物在扩增体系中的终浓度为100～1000nM；所述探针在扩增体系中的终浓度为50～500nM；所述海藻糖在扩增体系中的终浓度为1％～10％w/v；所述牛血清白蛋白在扩增体系中的终浓度为0.1％～5％w/v；所述HotStart Taq酶、逆转录酶、UNG酶在扩增体系中的终浓度为0.5U～5U；所述dATP、dUTP、dCTP、dGTP在扩增体系中的终浓度均为0.1mM～2mM；所述MgCl₂在扩增体系中的终浓度为1.5mM～10mM。

4.根据权利要求1所述的用于检测肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌的试剂盒，其特征在于，所述阳性质控品中含有肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌的扩增基因序列的质粒。

5.根据权利要求1-4任一项所述的用于检测肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌的试剂盒，其特征在于，所述检测试剂的制备方法为：

(1)将配制好的检测试剂溶液以单人份分装到PCR管中，放入-80℃条件下冻存8h以上；

(2)将冻好的检测试剂放入到真空冷冻干燥机中，设定冻干机程序为：

-50℃，1h，1大气压；

-40℃，5h，＜10Pa；

-10℃，2h，＜10Pa；

0℃，2h，＜10Pa；

30℃，5h，＜10Pa；

(3)干燥完成后，取出试剂，即为干粉形态。

6.一种采用权利要求1-5任一项所述的试剂盒的使用方法，该方法包括以下步骤：

(1)将样品的DNA模板、无RNase水、阳性质控品各25μL分别加入不同的检测管中，盖好管盖，进行荧光PCR检测；

(2)PCR扩增反应的条件为：50℃逆转录15～30min；92～97℃预变性1～10min；92～97℃变性10～15s；58～62℃退火35～50s；40～45个循环；

(3)有效性判定：

无RNase水检测出的Ct值为Undet或40，且阳性质控品检测出的Ct值≤35，否则实验视为无效；

(4)结果判读：

样本检测管Ct值为Undet或40，该样本结果判断为阴性，样本RNA提取失败、待测样本中不含RNA或含量低于检测限；

样本检测管Ct值≤35，该样本结果判断为对应的病原体阳性，样本检测成功；

样本检测管Ct值为38～40，需要复检一次，如果Ct值仍为38～40，则判断为阴性；

按照以上判读方法，结合样本检测管检出的肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌对应荧光通道的Ct值来判断三种病原体的检测结果。