[发明专利]基于微流控芯片检测多种病原体的试剂盒及其使用方法

权利要求书

1.一种基于微流控芯片的检测肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括有主动控制流路的多通量微流控核酸检测芯片、预装干粉检测试剂和阳性质控品；所述预装干粉检测试剂含有肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌的特异性保守序列的引物及Taqman荧光探针；

其中，特异性保守序列的引物序列为：

肺炎支原体，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；

肺炎衣原体，SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5；

嗜肺军团菌，SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；

特异性Taqman探针序列为：肺炎支原体，SEQ ID NO.3；

肺炎衣原体，SEQ ID NO.6；

嗜肺军团菌，SEQ ID NO.9。

2.根据权利要求1所述的基于微流控芯片的检测肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌的试剂盒，其特征在于，所述预装干粉检测试剂还包括有PCR缓冲液、海藻糖、牛血清白蛋白、dATP、dUTP、dCTP、dGTP，MgCl₂、HotStart Taq酶、逆转录酶和UNG酶。

3.根据权利要求2所述的基于微流控芯片的检测肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌的试剂盒，其特征在于，所述引物在扩增体系中的终浓度为100～1000nM；所述探针在扩增体系中的终浓度为50～500nM；所述海藻糖在扩增体系中的终浓度为1％～10％w/v；所述牛血清白蛋白在扩增体系中的终浓度为0.1％～5％w/v；所述HotStart Taq酶、逆转录酶、UNG酶在扩增体系中的终浓度为0.5U～5U；所述dATP、dUTP、dCTP、dGTP在扩增体系中的终浓度均为0.1mM～2mM；所述MgCl₂在扩增体系中的终浓度为1.5mM～10mM。

4.根据权利要求1所述的基于微流控芯片的检测肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌的试剂盒，其特征在于，所述阳性质控品中含有肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌的扩增基因序列的质粒。

5.根据权利要求1所述的基于微流控芯片的检测肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌的试剂盒，其特征在于，所述主动控制流路的多通量微流控核酸检测芯片具有微流控流道，包括一条出样主流道以及若干条分样流道；各分样流道分体设置，每个分样流道对应一个反应腔，能等分各个反应腔的试剂。

6.根据权利要求1-5任一项所述的基于微流控芯片的检测肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌的试剂盒，其特征在于，所述预装干粉检测试剂的制备方法为：

(1)将配制好的检测试剂溶液以单人份分装到PCR管中，放入-80℃条件下冻存8h以上；

(2)将冻好的检测试剂放入到真空冷冻干燥机中，设定冻干机程序为：

-50℃，1h，1大气压；

-40℃，5h，＜10Pa；

-10℃，2h，＜10Pa；

0℃，2h，＜10Pa；

30℃，5h，＜10Pa；

(3)干燥完成后，取出试剂，即为干粉形态。

7.根据权利要求6所述的基于微流控芯片的检测肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌的试剂盒，其特征在于，所述预装干粉检测试剂是预装在所述主动控制流路的多通量微流控核酸检测芯片中。

8.一种采用权利要求1-7任一项所述的试剂盒的使用方法，该方法包括以下步骤：

(1)将样品DNA/RNA共提取模板200μL加入微流控核酸检测芯片的加样孔中，盖好加样孔盖，放入微流控芯片检测仪中检测；

(2)PCR扩增反应的条件为：

92～97℃预变性1～10min；

92～97℃变性5～10s，58～62℃退火延伸15～30s，30～45个循环；

(3)有效性判定：

阴性对照孔是未加引物探针的空白孔，检测结果应为阴性，且阳性对照孔检测出为阳性，否则实验视为无效；

(4)结果判读：

根据对应的反应腔的检测信号给出结果，直接判断肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌的阴阳性结果。