[发明专利]一种抗原特异性B细胞筛选方法及其在单克隆抗体制备中的应用

说明书

本发明提供了一种单克降抗体的制备方法及其应用，所述制备方法包括以下步骤：步骤一，B细胞的获取、富集及纯化；步骤二，抗原特异性B细胞的获取；步骤三，将上述抗原特异性B细胞永生化细胞系；步骤四，一步法检测永生化细胞系阳性克隆；本发明提供了一种单克隆抗体的方法，该方法能获得抗原特异性B细胞以制备杂交瘤，减少了非抗原特异性细胞的干扰，大大改进传统方法的成功率，准确率；另外本发明采用一步法筛选阳性克隆株，比传统ELISA方法快速简便。

技术领域

本发明属于单克隆抗体技术领域，具体涉及一种抗原特异性B细胞筛选方法及其在单克隆抗体制备中的应用。

背景技术

抗体是机体在受抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。常规额抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中的其他蛋白成分一般抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。因而，常规血清抗体又称多克隆抗体 (polyclonal antibody)。由于常规抗体的多克隆性质，加之不同批次的抗体制剂质量差异很大使它在免疫化学相关诊断试剂研发中带来许多麻烦。

1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤细胞融合，形成B细胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征，既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限的快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系，即所谓单克隆抗体(monoclonal antibody)。与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。

目前，大多数的实验室制备抗体大多采用的是单克隆抗体技术，即用预定抗原免疫正常的Balb/c小鼠，用免疫小鼠的脾脏细胞和体外培养的无限制的骨髓瘤细胞融合，形成B细胞杂交瘤。利用ELISA技术筛选能够稳定分泌抗预定抗原的抗体的细胞株，最终将获得的细胞株通过体外培养或者诱生小鼠产生腹水得到需要的单克隆抗体。其中在筛选的过程中，得到产物的针对性就最终决定了得到的目标单克隆抗体是否可以有效的使用。一般实验室采用的筛选方法是：用预定免疫的抗原包被ELISA板条，4℃过夜后加入封闭液，4℃过夜，洗板。在ELISA板条中加入细胞培养上清，反应1.5小时后洗板，然后加入酶标二抗，经过显色和终止，通过450nm和630nm吸光值筛选得到具有稳定分泌所需抗体的克隆株细胞，因此，筛选克隆化在单克隆抗体的生产过程中直接导致了最终产物的针对性和有效使用率。

传统的ELISA筛选阳性克隆株的方法虽然被广泛的应用，但是，在实际的操作过程中，浪费了大量筛选的时间和原材料，最终产物的有效利用率偏低。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于：杂交瘤细胞的制备过程中对融合细胞株检测费时费力、成功率不高。

本发明涉及两个方面，具体而言，涉及一种抗原特异性B细胞筛选方法及其在单克隆抗体制备中的应用。

步骤一，B细胞的获取、富集及纯化：将免疫后小鼠脾细胞分离剪碎研磨，过200目筛网，采用密度梯度离心纯化；

步骤二，抗原特异性B细胞的获取，将以荧光或生物素标记的蛋白与步骤一中的B细胞进行特异性结合，随后用SA-Bead分选与蛋白特异性结合的细胞；

步骤三，将上述抗原特异性B细胞永生化细胞系：将步骤二中分离出的抗原特异性B 细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合，获得永生化的细胞系；

步骤四，一步法检测永生化细胞系阳性克隆：采用磁珠标记的抗原和荧光标记的二抗检测永生化的细胞系，实时检测。

第二方面本发明涉及上述单克隆抗体在特异性降钙素原方面的应用，比如制备降钙素原配对抗体，用于临床诊断。