[发明专利]一种记忆性免疫细胞的检测体系及其应用

说明书

本发明属于医学检测应用领域，涉及一种记忆性免疫细胞的检测体系及其应用，所述检测体系中的样本量为0.3‑0.8mL。本发明能够提高检测记忆T细胞再次受刺激后分泌的细胞因子灵敏度，提高以检测记忆T细胞分泌细胞因子为基础的辅助诊断试剂盒整体地灵敏度，减少漏检的可能。

技术领域

本发明属于医学检测应用领域，涉及一种记忆性免疫细胞的检测体系及其应用。

背景技术

细胞因子(cytokine)泛指一类跟机体炎症和免疫应答反应密切相关的小分子多肽糖蛋白。机体感染疾病时，一系列相关细胞子通过协调参与机体的免疫应答过程。以结核免疫为例，结核分枝杆菌通过T淋巴细胞介导引起机体Ⅳ型超敏反应，机体发挥T细胞免疫为主，多种细胞因子协同参与的免疫应答，主要由CD4+T细胞即T辅助性1型细胞(Th1)和CD8+T细胞即T辅助性2型细胞(Th2)介导。相关细胞因子包括肿瘤坏死因子(TNF)、白介素-2(IL-2)、白介素-10(IL-10)、干扰素-γ(IFN-γ)等。

据报道，通过检测记忆T细胞再次受特异性抗原刺激的反应程度，通常表现为分泌各类细胞因子，可以揭示机体感染疾病的状态，这是一种可靠的检测方法，如γ干扰素释放实验(IGRAs)。IGRAs是在体外检测T细胞经结核特异性抗原刺激之后产生和释放γ-干扰素能力的技术，借此判断细胞介导的免疫反应。IGRAs是采用结核分枝杆菌特有的2种抗原ESAT-6和CFP-10刺激受检者全血或外周血单个核细胞使T淋巴细胞产生大量γ-干扰素，然后用酶联免疫吸附法或酶联免疫斑点法检测γ-干扰素浓度或计数分泌γ-干扰素细胞的方法。

国际上广泛使用的IGRAs商业试剂盒有以下几种，即澳大利亚Cellistis公司产的QuantiFERON-TB Gold In-Tube(QFT-GIT)，德国Qiagen公司的QFT，QFT-Gold；英国OxfordImmunotec产的T-SPOT.TB，中国万泰的TB-IGRA。

QuantiFERON-TB Gold已被美国FDA批准作为检测结核分枝杆菌感染的体外辅助诊断。它使用模拟ESAT-6，CFP-10和TB7.7(p4)蛋白的混合多肽来刺激肝素化全血中的细胞，用ELISA的方法检测γ-干扰素来鉴别对这些多肽抗原的体外反应，此反应与结核分枝杆菌感染相关。

QFT则是最早被美国FDA批准上市的IGRAs产品，并且在许多国家的指导原则和推荐中是替代TST的优先选择。QFT是一种高特异性、可控的血液学检测方法，可用于辅助诊断TB感染，并且提供结果来显示个体对结核分枝杆菌抗原高特异性的T细胞反应。QFT采用酶联免疫吸附试验(ELISA)来检测与TB特异性抗原共同孵育后全血样本中的γ-干扰素反应。

QFT和QuantiFERON-TB Gold和TB-IGRA都是用0.8-1.2mL的血液来进行刺激实验。QFT和QuantiFERON-TB Gold是直接采血到刺激管中，从而进行后续检测。TB-IGRA是用精确分血1mL的血液来进行刺激实验。T-Spot TB则是需要从8mL成人的血液中分离出PBMC细胞后进行实验,要求每个检测孔含有25万个PBMC细胞。

通过细胞因子变化诊断疾病状态的方法依赖于检测标的细胞因子的高敏感度。以IGRAs为原理的商业化试剂盒为例，T-SPOT.TB、QFT-GIT检测记忆T细胞受结核抗原刺激后分泌IFN-γ的含量或分泌IFN-γ细胞数目的变化，从而判断机体是否感染结核分枝杆菌。据报道，T-SPOT.TB辅助诊断结核病的灵敏度达90％，但是T-SPOT.TB需先分离人外周血单核细胞(PBMC)，操作步骤繁琐。QFT-GIT方法操作相对比较容易，但是辅助诊断结核病的灵敏度仅达70％。目前有不少报道旨在于通过实验方法的调整提高QFT-GIT整体灵敏度，如提高孵育温度至39℃，即时孵育静脉血等，但在高温下T细胞会发生非特异性的激活，增加了检测的假阳性率。