[发明专利]一种脂质体的制备方法及制作脂质体佐剂的方法

说明书

本发明涉及一种脂质体的制备方法及其作为疫苗免疫佐剂的应用，提供的一种脂质体制备方法，包括如下步骤：1)称取氢化大豆磷脂HSPC、胆固醇CHOL、1，2‑二油酰氧基三甲基氯化铵DOTAP‑Cl、维生素VE，按质量分数70～90∶0～30∶10～20∶0.5的比例制成混合物；2)将步骤1所述混合物溶解于氯仿/甲醇溶剂中得到类脂的有机溶液备用，所述氯仿/甲醇溶剂由体积比为24∶72∶4‑5.1的氯仿、甲醇和超纯水组成；3)称取水溶性粉末状固体支持物置于250ml的圆底烧瓶中，再加入上述类脂的有机溶液，搅拌均匀，置于旋转蒸发仪上冰/水浴恒温的条件下旋转蒸去有机溶剂，其中所述固体支持物的质量是所述混合物质量的5倍，包括乳糖、蔗糖、甘露醇、氯化钠的一种或几种。该制备方法工艺简单，成本低，适于大量培养脂质体并应用于疫苗免疫佐剂。

技术领域

本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种脂质体的制备方法及其作为疫苗免疫佐剂的应用。

背景技术

疫苗接种防治疾病是一种非常有效的方法，但某些传统疫苗能引起不同程度的副作用。近年来，随着免疫学研究的不断深入及基因工程技术的迅速发展，活载体疫苗、DNA疫苗和蛋白质疫苗等新型疫苗的研究取得了可喜的进步。这些新型疫苗纯度高、特异性强，但免疫原性弱，诱导机体产生的免疫应答不够强，因此，运用既安全又有效的佐剂来增强疫苗效果已成为当前急待解决的问题。

目前唯一被正式批准用于人类疫苗的佐剂是铝佐剂(主要成分为氢氧化铝或磷酸铝)。尽管多年来的实践证明铝佐剂基本上是安全有效的，但它也有很大局限性，而且这种单一类型的佐剂无法满足多种疫苗对多种类型佐剂的不同需要。为满足疫苗产业的发展，运用一些新的手段和方法开发新型佐剂势在必行。在国外新型佐剂的研发已成为热点，而国内虽研究较多，但尚处于起步阶段。

1965年由英国的Bangham首先发现磷脂在水中可以自发形成脂质体(liposomes)以来，对其试验研究日渐广泛。脂质体的这种结构使其能够携带各种亲水的、疏水的和两性的物质，它们被包入脂质体内部水相，或插入类脂双分子层，或吸附、联接在脂质体的表面。作为模拟细胞膜和药物载体，脂质体的研究和应用正日渐深入与广泛。起初曾设想，将药物包裹在脂质体内部，能逃避或减轻宿主对药物产生免疫应答，但是1974年Allison和Gregoriadis发现，脂质体对掺在其中的白喉类毒素具有明显的免疫佐剂作用，从此揭开了脂质体作为免疫增强剂研究的序幕。随着人用脂质体疫苗资料的进一步积累，脂质体可望在不久的将来成为继铝佐剂之后又一种被批准用于人类疫苗的新型佐剂。

脂质体作为佐剂具有许多独特的优点：(1)抗原与脂质体单纯混合就可增强抗原的免疫原性，若包裹或固定在脂质体上则更强；(2)具有天然靶向性，可将抗原靶向网状内皮系统，从而优先被抗原递呈细胞(APC)所摄取；(3)副作用小、程度轻，无全身毒性反应，可生物降解，本身无毒性和免疫原性，尚未发现脂质体疫苗诱导变态反应和自身抗体的现象；(4)仓库效应，脂质体对包裹的抗原有缓释作用，使机体长时间保持高滴度抗体，减少抗原的剂量及接种次数；(5)可改变免疫应答的类型和方式，可同时诱导体液和细胞免疫，明显优于细胞免疫诱导力差的铝佐剂，增强体液免疫表现在抗体的亚型转换、滴度升高、持续时间长，还可产生免疫记忆；(6)脂质体中可包入单磷脂酰脂质A(MPL)、γ干扰素、白细胞介素2和细胞因子等，发挥协同作用，刺激和促进APC对抗原的加工、递呈及免疫细胞间相互作用；进一步增强体液和细胞免疫，同时减少了常规佐剂的用量、毒性以及抗原的用量；(7)脂质体具有抗原递呈作用，在无APC及主要组织相容性复合体分子时，脂质体内高浓度抗原亦可激活某些T细胞。

尽管随着DNA重组疫苗、合成肽疫苗等新型疫苗不断涌现，免疫佐剂研究越来越受人们的关注。但是由于佐剂加强免疫反应是一个非常复杂的过程，每一种抗原的合适的佐剂配方需要重新筛选，如何开发适用HPV病毒疫苗蛋白的免疫佐剂系统目前研究较少，也没有见到关于脂质体作为HPV病毒疫苗免疫佐剂的报道。本疫苗研发部决定运用纳米技术开发新型脂质体佐剂产品，不仅能用于后续疫苗产品，为具体的疫苗品种上市作出贡献，更在于为我国该领域做出了突破，学术意义和前景市场均较大。