[发明专利]检测环状RNA hsa_circ_0006148的引物、试剂盒和检测方法及其应用

权利要求书

1.检测环状RNA hsa_circ_0006148的引物，其特征在于，包括正向引物5’-TCTTAGACAGGCAGCGGAGG-3’；以及反向引物5’-AGAGGAGGAGACCGGAGATC-3’。

2.检测环状RNA hsa_circ_0006148的试剂盒，其特征在于，包括外周血样本的RNA提取试剂、权利要求1所述的检测环状RNA hsa_circ_0006148的引物、去基因组DNA反应体系及组成成分、逆转录反应体系及组成成分、qPCR反应体系及组成成分。

3.根据权利要求2所述的检测环状RNA hsa_circ_0006148的试剂盒，其特征在于，

去基因组DNA反应体系（总体积10 μL）：5×g DNA 去除剂缓冲液，组分0.1 mM CaCl₂缓冲液，2.0 μL；gDNA去除剂， 组分1 μg/μL DNase，2.0 μL；1μg/ μL总 RNA，2.0 μL；无RNA酶的dH₂O，2.0 μL；

逆转录反应体系（总体积20 μL）：去基因组DNA反应得到的反应液，其中RNA浓度为0.1μg/ μL，10.0 μL；200U/ μL逆转录酶，1.0 μL；RT引物，1.0 μL；5×缓冲液，成分为125mMMgCl₂、12.5mM dNTPs，4.0 μL；无RNA酶的dH₂O，4.0 μL；

qPCR反应体系（总体积20 μL）：荧光定量PCR预混液，其中RNA酶1μg/ μL ，Taq酶0.5U/μL，10.0 μL；10 μM PCR正向引物，0.5 μL；10 μM PCR反向引物，0.5 μL；逆转录反应得到的cDNA，cDNA浓度为0.1μg/ μL，1.0 μL；DEPC水，8.0 μL。

4.根据权利要求2所述的检测环状RNA hsa_circ_0006148的试剂盒，其特征在于，去基因组DNA反应的条件为42℃ 2 min ；4℃ ∞；逆转录反应条件为：37℃ 15 min，85℃ 5s；4℃∞；

qPCR反应分为三个阶段：

阶段1：95℃，30S，1次循环；

阶段2：95℃，5S，40次循环； 60℃，31S，40次循环；

阶段3：95℃，15S，1次循环；60℃，60S，1次循环；95℃，15S，1次循环。

5.根据权利要求2所述的检测环状RNA hsa_circ_0006148的试剂盒，其特征在于，去基因组DNA反应体系采用含有1 μg/μL DNase 的0.1 mM CaCl₂缓冲液；逆转录反应体系中采用含有200U/ μL逆转录酶的125mM MgCl₂、12.5mM dNTPs缓冲液体系；RT引物为olige dT引物和随机六聚引物；qPCR反应体系中的荧光定量PCR预混液中，RNA酶1μg/ μL，Taq酶0.5U/μL。

6.检测环状RNA hsa_circ_0006148的方法，采用权利要求2-5任意一项所述的试剂盒，其特征在于，包括如下步骤：（1）获得待检外周血样本；（2）从待检外周血样本中提取RNA；（3）从提取的RNA中去除基因组DNA；（4）对于获得的RNA进行逆转录至cDNA；（5）对于获得的cDNA通过qPCR法进行检测。

7.根据权利要求6所述的检测环状RNA hsa_circ_0006148的方法，其特征在于，待检外周血样本来自于癌症病人及正常人，所述的癌症为胃癌。