[发明专利]VdPHB基因在抗棉花黄萎病菌中的应用

说明书

本发明涉及作物病害领域，提供了一种VdPHB基因在抗棉花黄萎病菌中的应用，所述VdPHB基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ.ID.NO:2所示。通过对敲除突变体ΔVdphb的菌落形态、生长速率、胞外酶活性以及致病力进行测定，并和野生型的各项指标进行比较分析，确定VdPHB基因是棉花黄萎病菌致病基因，在黄萎病菌中抑制VdPHB基因表达可以降低黄萎病菌的危害。

技术领域

本发明涉及作物病害领域，具体涉及一种棉花黄萎病菌的致病基因VdPHB作为抗棉花黄萎病菌靶标基因的应用。

背景技术

在作物整个生产过程中，作物会遭遇各种各样的病害，给作物生产造成了极大的经济损失。其中，真菌引起的病害最为严重，真菌病害产生的损失约占作物总损失的70-80％。通过研究病原真菌的致病机制分离致病基因，并通过抑制致病基因的表达来控制真菌病害发生以及危害程度是作物病害防治的新途径。

棉花黄萎病是一种由大丽轮枝菌引起的土传性维管束真菌病害。由于大丽轮枝菌的生理型多、突变快、致病机理复杂所以导致棉花黄萎病很难防治。1935年棉花黄萎病通过引进的美国棉种“斯字棉”传入我国。在二十世纪五十年代棉花黄萎病快速传播，在八十年代末棉花黄萎病已经遍及我国各个棉区。进入九十年代后棉花黄萎病出现大面积爆发，尤其是1993年我国棉花黄萎病大爆发，被黄萎病感染的面积达到267万公顷、造成绝收的棉田达到13.8万公顷，损失皮棉约1亿公斤。之后在2003、2004、2006年再次大发生造成重大损失。据2012年国际轮枝菌大会报道统计，在2005-2010年间棉花平均产量2352万吨，由棉花黄萎病造成的损失高达30％，直接经济损失达到106亿美元。我国棉花生产总量占全球产量的四分之一，目前还没有有效防治棉花黄萎病的手段，棉花一旦被感染就会导致棉花产量以及纤维品质的大幅下降。棉花黄萎病因而被称为“棉花的癌症”，已经成为我国棉花稳产、高产、优产的主要障碍之一。

大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)属半知菌亚门、丛梗孢目、淡色孢科、轮枝菌属。大丽轮枝菌可以感染600多种不同的作物，具有广泛的寄主范围，寄主包括蔬菜(茄子、胡椒、马铃薯、番茄)、水果(葡萄、橄榄和草莓)、观赏花卉(菊花)、油籽作物(向日葵)、纤维作物(亚麻)和木本多年生作物。大丽轮枝菌致病机理有堵塞假说和毒素假说。研究人员认为菌体侵入到作物体内在导管中定产生大量菌丝，同时激发作物体内防御反应，使作物导管中产生胶状物质。菌丝和作物产生的胶状物体堵塞作物导管，阻碍水分的运输从而导致作物萎蔫。

毒素学说认为大丽轮枝菌侵入到寄主植株中后会分泌一些有毒蛋白或次级代谢产物，例如糖蛋白、细胞壁降解酶等来抑制寄主的防御反应从而引起细胞的凋亡，进而引起寄主的枯萎死亡。研究学者在大丽轮枝菌的粗提取的分泌物中分别加入蛋白降解酶和脂质降解酶后发出加入蛋白降解酶的提取物不再具有致病性，由此可以确定大丽轮枝菌分泌的致病毒素中蛋白质的成分具有重要的作用。因此，抑制黄萎病菌的扩展能够有效降低棉花黄萎病的危害。

为了进一步了解棉花黄萎病菌的致病机理，世界各国的研究学者开展了大量的研究。目前，研究人员从建立的大丽轮枝菌T-DNA插入突变体库中筛选到一些相关的致病基因。其中，一个编码富含谷氨酸的蛋白质(VdGARP1)，当将其敲除以后发现突变体的黑色素产生会受到影响。至关重要的是，ΔVdGARP1突变体的致病力明显降低。在大丽轮枝菌中还发现Vayg1同样参与黑色素的生成，ΔVayg突变体在BMM板上接种分生孢子之后分析大丽轮枝菌6种黑色素生物合成相关基因的表达情况，发现6种基因的表达量均表达下调，ΔVayg突变体产生了少量的微菌核和黑色素。在致病力方面，ΔVayg突变体的致病力下降，在入侵定殖定殖时发现其入侵定殖受到抑制，而且致病力也比野生型低，说明VAYG不仅仅参与了微菌核和和黑色素的形成还与黄萎病的致病相关。大丽轮枝菌微菌核萌发产生菌丝或芽管，它们在根部表面纵向延伸，随后会观察到一些肿状的菌丝在细胞表皮连接处穿孔形成狭窄的穿透栓帮助大丽轮枝菌侵染定殖。