[发明专利]一种改造CHO-K1细胞提高抗体糖链中半乳糖含量的方法

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种改造CHO‑K1细胞提高抗体糖链中半乳糖含量的方法。本发明对抗体生产常用细胞株CHO‑K1进行了研究，意外发现在此细胞株的遗传背景下过表达GT，可以提高CHO‑K1细胞所表达的抗体的糖链中半乳糖含量。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种改造CHO-K1细胞提高抗体糖链中半乳糖含量的方法。

背景技术

抗体在疾病治疗方面发挥着重要的作用，ADC(抗体药物偶联)类抗体药由于其偶联抗体和小分子细胞毒性药物以高效的靶向杀伤性逐渐进入研究的焦点。通过抗体糖基化偶联实现的ADC逐渐得到人们的广泛关注。人类免疫球蛋白根据重链性质的不同分为IgG、IgM、IgA、IgE、IgD 5种，临床上最为常用的为IgG。IgG重链Fc段的CH2区域内有一个保守的N-糖基化位点Asn297。该位点的糖基化结构为核心岩藻糖基化的复杂双天线模型，在不同的糖基转移酶的作用下，糖链上分别添加岩藻糖、半乳糖、甘露糖、唾液酸等，使抗体呈现出高度的异质性。抗体糖基化的不均一性，是通过糖基偶联实现ADC的一大技术难题。

发明内容

为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种改造CHO-K1细胞提高抗体糖链中半乳糖含量的方法。

为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种表达抗体的方法，包括如下步骤：

(1)构建重组质粒：将GT基因插入第一表达载体中，构建GT重组质粒，将抗体重链编码基因插入到第二表达载体中，构建抗体重链重组质粒，将抗体轻链编码基因插入到第三表达载体中，构建抗体轻链重组质粒；

(2)将步骤(1)所获得的GT重组质粒、抗体重链重组质粒及抗体轻链重组质粒共转染至CHO-K1细胞中，进行抗体表达，在表达产物中分离获得抗体。

进一步地，步骤(1)中，所述GT基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，步骤(1)中，所述第一表达载体选自pcDNA3.1(+)(Ampicillin)、pVAX、pCMV、pGL、pMZ等。

进一步地，步骤(1)中，所述GT基因插入到第一表达载体中的限制性酶切位点之间。例如，所述GT基因插入到第一表达载体中的HindIII酶和XhoI酶的限制性酶切位点之间。

进一步地，步骤(1)中，所述第二表达载体选自pLONZA、pcDNA、pVAX、pCMV、pGL、pMZ等。

进一步地，步骤(1)中，所述抗体重链编码基因插入到第二表达载体中的限制性酶切位点之间。例如，所述抗体重链编码基因插入到第二表达载体中的BamH I和EcoRI的限制性酶切位点之间。

进一步地，步骤(1)中，所述第三表达载体选自pLONZA、pcDNA、pVAX、pCMV、pGL、pMZ等。

进一步地，步骤(1)中，所述抗体轻链编码基因插入到第三表达载体中的限制性酶切位点之间。例如，所述抗体轻链编码基因插入到第三表达载体中的BamH I和EcoRI的限制性酶切位点之间。

进一步地，步骤(1)中，具体为：GT基因通过酶切、连接的方法插入到第一表达载体，第一连接产物转化感受态细胞，筛选正确连接的载体作为构建成功的GT重组质粒。抗体重链编码基因通过酶切、连接的方法插入到第二表达载体，第二连接产物转化感受态细胞，筛选正确连接的载体作为构建成功的抗体重链重组质粒。抗体轻链编码基因通过酶切、连接的方法插入到第三表达载体，第三连接产物转化感受态细胞，筛选正确连接的载体作为构建成功的抗体轻链重组质粒。

进一步地，步骤(2)中，GT重组质粒、抗体重链重组质粒及抗体轻链重组质粒之间的质量比例范围是(2-5)：50：50。