[发明专利]一种产生p-羟基肉桂酸的基因工程菌株及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种产生p-羟基肉桂酸的基因工程菌株，其特征在于具有包含下述核苷酸序列的DNA片段的表达构建物；

(1)编码序列表中SEQ ID No:1所示氨基酸序列的多核苷酸序列；

(2)编码序列表中SEQ ID No:2所示氨基酸序列的多核苷酸序列；

(3)编码序列表中SEQ ID No:3所示氨基酸序列的多核苷酸序列；

(4)序列表中SEQ ID No:4所示的核苷酸序列。

2.权利要求1所述的产生p-羟基肉桂酸的基因工程菌株，其特征在于：所述的表达构建物是装配到出发菌株的基因组上，或是装配到能够在出发菌株细胞中存在的质粒上。

3.权利要求1所述的产生p-羟基肉桂酸的基因工程菌株，其特征在于：所述的出发菌株为内源存在苯丙氨酸和/或苯丙氨酸生物合成前体物质的大肠杆菌。

4.权利要求1所述的产生p-羟基肉桂酸的基因工程菌株，其特征在于包含有下述表达构建物：在出发载体pACYC184的多克隆位点装配有包含(1)所述核苷酸序列的DNA片段所得的表达构建物；在出发载体pET29a的多克隆位点装配有包含(2)和(3)所述核苷酸序列的DNA片段所得的表达构建物；在出发载体pCL1920的多克隆位点装配有包含(4)所述核苷酸序列的DNA片段所得的表达构建物。

5.权利要求4所述的产生p-羟基肉桂酸的基因工程菌株的构建方法，所述的方法包括：

①以拟南芥cDNA为模板，扩增SEQ ID No:1的编码基因PAL，装配至出发载体pACYC184，转化出发菌株，构建L-苯丙氨酸生物合成反式肉桂酸的代谢路径，所述基因PAL表达的是苯丙氨酸脱氨酶(phenylalanine ammonia lyase)；

②以拟南芥cDNA为模板，扩增SEQ ID No:2的编码基因C4H和SEQ ID No:3的编码基因CPR，装配至出发载体pET29a，转化出发菌株，构建反式肉桂酸生物合成p-羟基肉桂酸的代谢路径，所述基因C4H和基因CPR表达的分别是反式肉桂酸-4-羟化酶(trans-cinnamate-4-hydroxylase)和细胞色素P450还原酶(cytochrome P450reductase)；

③以大肠杆菌基因组为模板，扩增SEQ ID No:4所示序列，装配至出发载体pCL1920，转化出发菌株，下调吡啶核苷酸转氢酶SthA的表达；

所述出发菌株为带有T7RNA聚合酶的大肠杆菌。

6.权利要求1所述的产生p-羟基肉桂酸的基因工程菌株的用途，用于生产p-羟基肉桂酸。

7.一种p-羟基肉桂酸生产方法，其特征在于：应用权利要求1所述的产生p-羟基肉桂酸的基因工程菌株生产p-羟基肉桂酸；所述的方法包括：

(i)种子培养：活化所述产生p-羟基肉桂酸的基因工程菌株，后接种至装有30mL种子培养基的250mL三角瓶中，于36-38℃，100-220rpm摇床培养10-24h；

(ii)发酵培养：以5-10%的接种量将步骤(i)的种子培养物接种至装有50mL发酵培养基的500mL三角瓶中，25-38℃，150-250rpm进行发酵培养，通过移液器补加氨水维持pH在6.8-7.2，补加80%(m/v)葡萄糖溶液维持菌株的生长与p-羟基肉桂酸的生产，发酵周期24-72h，即得。

8.权利要求7所述的p-羟基肉桂酸生产方法，其特征在于：所述步骤(i)中的种子培养基成分为：2-20g酵母蛋白胨，1-10g酵母提取物，1-8g KH₂PO₄，2-10g K₂HPO₄，1-7g(NH₄)₂HPO₄，0.1-2g MgSO₄，10-50g葡萄糖，用去离子水定容至1L。