[发明专利]一种基于三代测序平台的HLA基因分型方法

说明书

本发明公开了一种基于三代测序平台的HLA基因分型方法，包括以下步骤：(1)对需要分型的HLA基因进行PCR扩增；(2)PCR所得产物检测合格后，进行三代测序，获得原始数据；(3)将原始数据与参考基因序列进行长序列比对；(4)比对后对测序错误进行矫正；(5)分相得到单体型序列；(6)分型判断。相比于现有的HLA基因分型方法，本发明的HLA分型方法对计算资源要求少、分型快、分辨率高，对临床移植组织配型、群体遗传学、人类学和进化学等应用和基础研究工作具有重要价值。

技术领域

本发明属于生物信息学领域，具体涉及基于三代测序平台的HLA基因分型方法。

背景技术

人类白细胞抗原系统是人类主要组织相容性复合体(Major histocompatibilitycomplex，MHC)的别称。它位于人类6号染色体短臂，由一系列紧密连锁的基因座构成。HLA基因是人类基因组中多态性最高，迄今为止人类最复杂的遗传系统之一。HLA基因编码的蛋白具有识别自体与非体，调节免疫应答等作用。匹配上正确而又高精度的HLA型别对骨髓移植、器官移植是否成功起着决定性的作用。HLA I类(HLA-A、HLA-B、HLA-C)和HLAII类(HLA-DRB1、HLA-DPB1、HLA-DQB1)在配型中扮演主要角色。此外，HLA基因的型别还与强直性脊椎炎、糖尿病等许多疾病密切相关。

HLA分型的分辨率可以分为以下四类：

a.2位为等位基因；

b.4位为特定HLA蛋白质；

c.6位为特定HLA编码序列(CDS)；

d.8位为特定的HLA基因序列包括未翻译区和内含子。

HLA系统研究从70年代到80年代末期主要是血清学研究；90年代以来，HLA进入了分子水平研究阶段。HLA分型技术同样走过了这一历程。建立于60年代的血清学及细胞学分型技术主要侧重于分析HLA产物特异性。1991年第11届国际HLA专题讨论上提出了HLA的DNA分型方法，随着测序技术的突飞猛进，基于DNA序列的分型方法已经取代了传统的血清学及细胞学分型方法。现DNA分型方法主要分为两种：基于核酸序列识别的方法和基于序列分子构型的方法。基于核酸序列识别的方法主要有：PCR-RFLP,PCR-SSO,PCR-SSP和PCR-SBT(Sequence Based Typing，测序分型技术)。其中PCR-SBT测序方法是现世界卫生组织(WHO)推荐的HLA分型方法的“金标准”。

PCR-SBT方法通过PCR扩增相应HLA的基因区域，对扩增产物测序，测序结果经过专业的软件分型，从而得到HLA的基因型别信息。可达到四位的分辨率，并能检测到新的等位基因。相对之前传统的方法，其分辨率、准确度较高，可达到4位的分辨率。然而，PCR-SBT仍存在以下技术缺陷：(1)成本高，时间相对较慢；(2)PCR-SBT分型方法主要针对多态性位点比较集中的2、3、4号外显子的测定来确定其基因型，而对第1、5、6、7号外显子不进行测序，由于HLA高度遗传多态性，在第1、5、6、7外显子上也有一定的多态性，因此现有的方法测定2-4外显子多态性，可能引起部分等位基因无法指定，存在歧义的结果，严重影响临床工作；(3)无法获得基因全长序列，对内含子和UTR区的序列无法获得；(4)具有一定的随机、推断引入的错误；(5)对可变剪切位点的变异判别不敏感；(6)分型结果只能达到“4位分辨率”。

基于二代测序的分型方法，对HLA基因目的片段进行捕获或PCR扩增，将二代测序短序列进行拼接或组装，根据序列间重叠和连锁关系，构建单体型，对外显子区域进行序列或SNV/Indel的判定；和数据库的序列比较，分型。相对于之前基于一代测序的PCR-SBT方法，该方法降低了成本，提高了多样品的分型速度。二代测序易造成错误比对，很难跨越重复序列，并且由于PCR造成的GC偏好往往导致GC富集区域的错误覆盖，影响变异检测的准确性。测序读长短，需要依赖拼接和组装、连锁分相等可能引入错误，尤其是SNP较少的区域，很难保证分相的准确性。无法获得基因全长，无法全面地揭示HLA的多态性。