[发明专利]针对人釉原蛋白肽的单克隆抗体的制备方法在审
| 申请号： | 201810191770.7 | 申请日： | 2018-03-08 |
| 公开（公告）号： | CN108409859A | 公开（公告）日： | 2018-08-17 |
| 发明（设计）人： | 程岚;束蓉;单玉飞 | 申请（专利权）人： | 上海交通大学医学院附属第九人民医院 |
| 主分类号： | C07K16/18 | 分类号： | C07K16/18;C12N15/70;C12N15/12 |
| 代理公司： | 上海精晟知识产权代理有限公司 31253 | 代理人： | 冯子玲 |
| 地址： | 200001 *** | 国省代码： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 单克隆抗体 人釉原蛋白 镍柱亲和层析 杂交瘤细胞 融合蛋白 筛选 小鼠 制备 重组原核表达质粒 生产单克隆抗体 重组人釉原蛋白 纯化融合蛋白 骨髓瘤细胞株 原核表达质粒 杂交瘤细胞系 重组质粒转化 大肠杆菌 编码序列 表达菌株 蛋白免疫 免疫动物 取脾细胞 细胞融合 阳性小鼠 诱导表达 构建 酶切 去除 标签 合成 克隆 成功 基因 | ||
1.一种针对人釉原蛋白肽的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：通过Genebank获得全长人釉原蛋白的cDNA编码序列，筛选该序列中不存在而在质粒pET28a(+)中存在克隆位点的内切酶将目的基因克隆入载体；
步骤二：合成所述的全长人釉原蛋白基因，合成的全长人釉原蛋白基因上下游分别携带BamHI和XhoI酶切位点，通过双酶切将所述的全长人釉原蛋白基因插入改造后的载体质粒pET28a-SUMO；
步骤三：将所述的质粒pET28a-SUMO-hAm送测序鉴定，将经鉴定的质粒pET28a-SUMO-hAm转化表达菌株E.coli.BL21感受态细胞，得到克隆表达菌株；
步骤四：将所述的克隆表达菌株接种到含有卡那霉素的液体LB培养基中，活化过夜，按20％接种37℃培养2h，OD600值达0.6时，诱导，将细菌沉淀，冰上重悬，加入溶菌酶超声破菌，离心，取上清；
步骤五：将所述的上清用滤器过滤后上镍柱，反复洗涤镍柱去除未结合的杂蛋白，加入蛋白酶，22℃消化过夜，收集蛋白rhAM；
步骤六：将所述的rhAm分三次免疫6周龄BALB/C小鼠，取已免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞株进行细胞融合，对细胞上清中抗体进行ELISA检测筛选阳性杂交瘤细胞，利用有限稀释法将阳性杂交瘤细胞克隆化，同时对所产生的单克隆抗体进行特征分析及纯度鉴定，获得稳定的杂交瘤细胞株H10G1；
步骤七：将杂交瘤细胞株H10G1再接种到小鼠腹腔内，得到的腹水采用proteinA/G亲和柱纯化后测定效价，得到所述的针对人釉原蛋白肽的单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的针对人釉原蛋白肽的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤四中，所述的卡那霉素浓度为50μg/ml。
3.根据权利要求1所述的针对人釉原蛋白肽的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤四中，诱导剂采用IPTG。
4.根据权利要求1所述的针对人釉原蛋白肽的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤四中，冰上重悬采用10倍体积的TBS。
5.根据权利要求1所述的针对人釉原蛋白肽的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤五中，蛋白酶为SUMO蛋白酶。
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