[发明专利]一株高底物专一性酰基转移酶的珍贵束丝放线菌及其应用

说明书

本发明公开了一株高底物专一性酰基转移酶的珍贵束丝放线菌，为珍贵束丝放线菌(Actinosynnema pretiosum)X4732,已于2018年2月5日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO.60327。本发明采用连续易错PCR方法体外突变酰基转移酶的基因，以酰基转移酶缺失菌株为出发菌，通过接合转移技术建立含有酰基转移酶基因的突变体库，筛选获得正突变株，通过发酵验证、传代培养获得遗传性状稳定的珍贵束丝放线菌X4732。本发明菌株的安丝菌素AP‑3合成水平比原始菌株X47高2.7倍，可应用于工业化发酵生产。

技术领域

本发明属于微生物育种和生物技术领域，具体涉及一株高活性酶的珍贵束丝放线菌及其应用。

背景技术

安丝菌素(ansamitocin)是由珍贵束丝放线菌(Actinosynnema pretiosum)产生的安莎类抗生素。安丝菌素是一类高效的抗肿瘤药物，研究证实安丝菌素能够通过与微管结合抑制60种肿瘤细胞的增殖，临床试验表明安丝菌素药物对肺腺癌、肺鳞癌和肺肥大细胞癌等均有疗效。由于安丝菌素具有很强的细胞毒性，一般利用抗体的靶向作用将药物分子靶向肿瘤，从而降低临床化疗中药物的非特异性全身毒性。罗氏公司的抗癌药物Trastuzumab-DM1(T-DM1)是第一个成功上市的安丝菌素抗体偶联药物(DM1是安丝菌素的衍生物)，2013年被FDA批准治疗HER2受体阳性的乳腺癌转移和晚期病人。另外，还有多个安丝菌素衍生物的抗体偶联药物正在进行临床试验，比如：SAR-408701由癌胚抗原相关细胞粘附分子5和安丝菌素衍生物DM1组成，用于治疗实体肿瘤；BT-062由靶向CD138的单克隆抗体和安丝菌素衍生物DM1和DM4组成，用于治疗多发性骨髓瘤；SAR3419由人源化抗-CD19单克隆抗体和安丝菌素衍生物DM4组成，用于治疗包括非霍奇金淋巴瘤的B-细胞恶性肿瘤。

珍贵束丝放线菌发酵法生产安丝菌素获得的是一类安丝菌素混合物，主要含有AP-2、AP-3和AP-4组份，AP-2、AP-3和AP-4之间的差异在于C-3位羟基连接的酰基侧链不同，例如AP-2为丙酰基，AP-3为异丁酰基，AP-4为异戊酰基(如图1所示)。其中AP-3组份是用于开发安丝菌素衍生物的中间体，通过化学合成可以将AP-3转化成DM1和DM4等衍生物并用于抗体偶联药物开发，但是一般发酵液中AP-3组份仅占60％左右。此外，安丝菌素AP-3的发酵产量也偏低，严重影响安丝菌素的工业化生产，也为安丝菌素抗体偶联药物的新药开发和临床应用带来阻碍。因此研发安丝菌素AP-3高产菌株具有非常重要的工业价值。

野生型珍贵束丝放线菌的安丝菌素AP-3产量很低，所以现有的珍贵束丝放线菌工业菌株都是通过多轮诱变筛选得到的突变株，但是常规诱变育种技术的效率较低，成为制约安丝菌素AP-3生产技术提高的一个瓶颈。

酰基转移酶是安丝菌素前体添加异丁酰基侧链合成安丝菌素AP-3的关键酶，该酶活性提高时能够提高向安丝菌素添加异丁酰基侧链的催化效率，因此通过对酰基转移酶进行基因改造有望获得安丝菌素AP-3高产菌。但是酰基转移酶不仅具有催化异丁酰基修饰安丝菌素的活性，还能催化其他酰基修饰安丝菌素的活性，目前还不知道这些修饰作用的专一性与那些位点有关。由于基因改造的位点难以选择，目前尚未有关于对酰基转移酶进行基因改造而获得安丝菌素AP-3高产菌的报道。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的第一个目的是提供一株高底物专一性酰基转移酶的珍贵束丝放线菌及其应用。采用定向进化的策略，对克拉维胺酸氨基乙酰化酶进行定向改造，并配合高通量筛选技术获得高底物专一性酰基转移酶，进而得到安丝菌素AP-3高产菌株。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的一个方面涉及一种高底物专一性酰基转移酶，其具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

本发明的另一个方面涉及一种编码SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的基因。