[发明专利]一种miR-574-5p靶基因筛选的方法

权利要求书

1.一种miR-574-5p靶基因筛选的方法，其特征在于，包括下列步骤：

1)以山羊基因组DNA为模板，在Taq DNA聚合酶、缓冲环境、Mg²⁺、dNTPs存在的情况下，利用引物MAP3K9在PCR条件下进行扩增，确定得到的PCR产物为MAP3K9基因3'UTR区的序列；

2)构建双荧光素酶报告系统，检测荧光素酶活性，初步鉴定miR-574-5p的靶基因；

3)采用RT-qPCR法检测miR-574-5p对MAP3K9基因在mRNA水平的影响；

4)采用Western blot法检测miR-574-5p对MAP3K9基因在蛋白水平的影响。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述的引物MAP3K9如下所示，其中的下划线为XhoI和NotI内切酶的酶切位点；

上游引物F：5'-CGGCTCGAGCCCATCTCCAGCTCCTTTCC-3'；

下游引物R：5'-TTGCGGCCGCTCCTCTCTGCACCTGCTACT-3'。

所述的PCR扩增的条件是：

15μL反应体系，包括DNA模板0.5μl，7.5μl的MasterMix，引物MAP3K9的上游引物F和下游引物R各0.5μl，加灭菌水至15μl；

所述的利用引物MAP3K9的PCR反应程序为：94℃预变性4min，94℃变性30s，退火温度为60℃，退火时间30s，72℃延伸30s，共进行30个循环，最后72℃充分延伸10min，4℃保存。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所述的构建双荧光素酶报告系统，检测荧光素酶活性，初步鉴定miR-574-5p的靶基因的具体方法为：

分别构建野生型及突变型报告基因质粒；

收集对数生长期的293T细胞，按照脂质体Lipofectamine2000转染说明书分别将miR-574-5p模拟物、阴性对照和MAP3K9荧光素酶报告载体共转入293T细胞，分为4组：野生型+miR-574-5p模拟物、野生型+阴性对照、突变型+miR-574-5p模拟物和突变型+阴性对照；

培养24h后，检测不同组别萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的强度，用萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶强度的比值计算相对荧光素酶的活性。