[发明专利]一种miR-181b靶基因筛选的方法

说明书

本发明公开了一种筛选miR‑181b靶基因的方法，该方法以山羊卵巢组织cDNA为模板，在Taq DNA聚合酶、缓冲环境、Mg²⁺、dNTPs存在的情况下，利用引物RUNX1在PCR条件下进行扩增，得到确定的PCR产物为RUNX1基因3'UTR区的序列；然后构建双荧光素酶报告系统，检测荧光素酶活性，初步鉴定miR‑181b的靶基因；采用RT‑qPCR法检测miR‑181b对RUNX1基因在mRNA水平的影响；采用Western blot法检测miR‑181b对RUNX1基因在蛋白水平的影响。明确了RUNX1 3'UTR区存在与miR‑181b的结合位点，利用现代分子生物技术验证了miR‑181b与靶基因RUNX1的靶向调控关系，miR‑181b可以抑制RUNX1基因在mRNA和蛋白水平上的表达，进一步确认了RUNX1是miR‑181b的目标靶基因。为进一步研究miR‑181b对奶山羊乳卵巢发育和产羔性能的影响奠定了基础。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及分子克隆、RT-qPCR和Western blot检测技术，具体涉及一种miR-181b靶基因筛选的方法，主要通过构建双荧光素酶报告载体，运用现代分子生物技术探寻并验证miR-181b的靶基因。

背景技术

miRNA是一种较短的(21-23个核苷酸)、进化保守的、非编码的RNA分子，具有转录后调控基因表达的功能，首次在秀丽隐杆线虫中被发现，其可通过与靶基因的3'非编码(UTR)结合，抑制mRNA翻译成蛋白。miRNA的调控相当复杂，每种miRNA能通过不同的信号通路调控多个靶基因，而每个靶基因可能同时受到几种miRNA的调节。miRNA作为一种重要的调控因子，广泛存在于动物体内，调控着动物体内大约1/3基因的表达，在哺乳动物生长发育、细胞分化、细胞增殖、细胞凋亡、细胞内环境稳态等生命活动中起到重要的调节作用，研究表明miRNA通过调控靶基因的表达对卵巢颗粒细胞的增殖、分化、凋亡、激素分泌等功能具有重要的调节作用。

成熟的miRNA结合到RISC之后，通过两种方式发挥其在生物体内的功能：

(1)miRNA与靶基因mRNA完全匹配互补配对，降解靶基因，从而抑制基因的表达。在植物体内，几乎全部miRNA都是通过这种方式来抑制基因的表达，这也是动物和植物的miRNA之间重要的区别，并且在植物体内miRNA与靶基因的结合位点不仅仅局限于3'UTR内，靶基因的转录区域也可以进行结合。

(2)miRNA通过与靶基因不完全互补配对结合，抑制mRNA在翻译过程中基因的表达，从而使基因不能正常翻译表达形成功能蛋白，以此来达到基因表达调控的目的。这是在动物体内主要的调节方式，当然也存在mRNA与靶基因完全互补配对从而降解靶基因的调节方式。

研究发现，大多数miRNA通过使其靶mRNA的翻译抑制或降解来抑制基因表达。miRNA与靶基因相结合，在细胞凋亡、增殖、代谢、分化、肿瘤转移、发育等多种生物过程中发挥重要的作用。快速准确的鉴定miRNA的靶基因，对于研究miRNA与靶基因之间的相互作用关系和参与的生物过程以及在信号通路中发挥的作用具有很大的研究价值。目前研究miRNA的方法主要有生物信息学方法和生物学试验方法。

动物源miRNA主要通过与靶基因mRNA的3'UTR碱基互补结合，从而调控靶基因的表达，因此动物源miRNA的靶位点主要位于靶基因mRNA的3'UTR，同时这些区域往往包含多个miRNA的多个靶位点，这些靶位点往往具有物种间保守性，且无明显二级结构。目前寻找miRNA靶基因的方法主要有生物信息学以及生物实验方法。生物信息学方法主要是利用已经确定的miRNA序列和它们的靶基因序列相互匹配的规律，根据生物学的几个原则设计具有针对性的软件来进行，如TargetScan、miRanda、RNAhybrid、TargetScanS、PicTar、DIANA-microT、FindTar和RNA22等软件。生物信息学的方法只是通过算法为研究人员提供可能性最大的参考信息，还需要通过实验进行验证。miRNA与靶基因间的相互作用具有一定的规律性。